Dane oryginału:

GENOMES, 4TH EDITION by Terry A. Brown

© 2018 by Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC

All Rights Reserved. Authorised translation from the English language edition published by CRC Press, a member of the Taylor & Francis Group LLC

ZESPÓŁ TŁUMACZY

z Instytutu Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski

Aleksandra Dmochowska rozdziały 7, 8, 9, 12.2, 12.3, 12.4, 14

Agnieszka Dzikowska rozdziały 1, 10, 11, 13

Paweł Golik rozdziały 16, 17, 18

Anna Grzelak, Michał Koper, Witold Jachymczyk rozdziały 4, 12.1, 12.5, 15

Katarzyna Tońska rozdziały 2, 3, 5, 6

Piotr Węgleński przedmowa, wstęp

Projekt okładki i stron tytułowych Lidia Michalak

Ilustracja na okładce sm1rkd1ngo/123RF

Wydawca Katarzyna Włodarczyk-Gil

Koordynator ds. redakcji Renata Ziółkowska

Redakcja i korekta Joanna Forysiak

Koordynator produkcji Mariola Grzywacka

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwa Naukowego PWN

Monika Lipiec/Woblink

Książka, którą nabyłeś, jest dziełem twórcy i wydawcy. Prosimy, abyś przestrzegał praw, jakie im przysługują. Jej zawartość możesz udostępnić nieodpłatnie osobom bliskim lub osobiście znanym. Ale nie publikuj jej w internecie. Jeśli cytujesz jej fragmenty, nie zmieniaj ich treści i koniecznie zaznacz, czyje to dzieło. A kopiując jej część, rób to jedynie na użytek osobisty.

Szanujmy cudzą własność i prawo.

Więcej na www.legalnakultura.pl

Polska Izba Książki

Copyright © by Wydawnictwo Naukowe PWN SA

Warszawa 2019

ISBN 978-83-01-20885-1

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2019 r., (wyd. III)

Warszawa 2019

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

02-460 Warszawa, ul. Gottlieba Daimlera 2

tel. 22 69 54 321, faks 22 69 54 288

infolinia 801 33 33 88

e-mail: pwn@pwn.com.pl; reklama@pwn.pl

www.pwn.pl

Przedmowa

Od ukazania się poprzedniego wydania tej książki nastąpił ogromny postęp w rozumieniu natury genomów. W roku 2007 sekwencjonowanie drugiej generacji znajdowało się jeszcze w powijakach, a wysoko wydajne metody obecnie stosowane w transkryptomice i proteomice dopiero zaczynały być wykorzystywane. Ich eksploatacja doprowadziła w ciągu ostatnich 10 lat do ekspotencjalnego wzrostu liczby gatunków, dla których sekwencje genomów są obecnie dostępne, umożliwiło też zbadanie genomów znacznej liczby osobników danego gatunku. Poznanie wielkiej liczby sekwencji genomów miało ogromny wpływ na genomikę bakterii i doprowadziło do sformułowania koncepcji pangenomiki oraz wykrycia zjawiska powszechnego transferu genów między gatunkami. Nasza znajomość genomów organizmów eukariotycznych przeszła podobnie dramatyczną zmianę związaną z odkryciem nowych rodzajów niekodującego RNA, włączając w to ogromną liczbę długich cząsteczek RNA transkrybowanych przez, jak się wydawało, międzygenowe regiony wielu genomów.

Genomy 4 zachowują układ podobny do stosowanych w poprzednich wydaniach, książka jest podzielona na cztery części: sekwencjonowanie genów wraz z przypisaniem im określonych białek, anatomia genomu, funkcjonowanie genomu oraz replikacja i ewolucja genomów. Do pozostałych rozdziałów wprowadzono tylko niewielkie zmiany, jednak cały tekst został uaktualniony i w wielu rozdziałach poddany rewizji. W szczególności rozwój transkryptomiki i genomiki osiągnął taki poziom, że w Genomach 4 można było opisać procesy transkrypcji i translacji zachodzące w całych genomach, a nie na podstawie procesów ekspresji pojedynczych genów. Było to moim celem, gdy w roku 1999 przygotowywałem pierwszą wersję Genomów, ale stan wiedzy w tym czasie pozwalał jedynie na opisywanie ekspresji genów, a nie całych genomów. Ciągle jeszcze nie jesteśmy w stanie opisać ekspresję genomu jako jednego zintegrowanego procesu, ale jesteśmy już blisko i mam nadzieję, że w Genomach 4 mogłem przekazać czytelnikowi przynajmniej niektóre cechy ekspresji całych genomów.

Genomy 4 były przygotowywane przez długi czas i chciałbym podziękować Liz Owen z Garland Science za jej nieustający entuzjazm dla tej książki i za jej delikatne przypomnienia o zbliżających się terminach. Chcę również podziękować Dawidowi Borrowdale’owi i Georginie Lucas z Garland za kierowanie produkcją książki i Matthewowi McClementsowi za jego znakomite ilustracje. Podobnie jak poprzednie wydania Genomy 4 nie byłyby nigdy ukończone, gdyby nie pomoc mojej żony Keri. Podziękowania zamieszczone w pierwszym wydaniu: „jeżeli znalazłeś tę książkę użyteczną, to powinieneś podziękować Keri, ponieważ to jej zawdzięczmy, że książka została napisana”, są aktualne również dla tego wydania.

T. A. Brown

Manchester

Uwagi dla czytelników

Starałem się uczynić czwarte wydanie Genomów tak przyjaznym, jak to tylko możliwe. Książka zawiera wiele rozwiązań mających pomóc czytelnikowi i sprawić, by była skuteczną pomocą w nauce i uczeniu.

Organizacja książki

Genomy 4 są podzielone na cztery części.

Część I – Badanie genomów. Pierwszy rozdział tej części zapoznaje czytelnika z genomami, transkryptomami i proteomami, podczas gdy rozdział drugi jest poświęcony metodom, takim jak PCR i klonowanie, które były używane w pregenomowej erze do badania pojedynczych genów. W rozdziale trzecim opisane są techniki służące do sporządzania map genetycznych i fizycznych, co jest ciągle istotne w wielu projektach poświęconych badaniu genomów. W rozdziale 4 omówione są metody pozyskiwania sekwencji DNA i ich składania w celu otrzymania wstępnych i ostatecznych sekwencji genomów. Dwa następne rozdziały są poświęcone metodom analizy sekwencji genomów: rozdział 5 identyfikowaniu genów i innych właściwości genomów, a rozdział 6 funkcjonalnej analizie genów, które zostały zidentyfikowane.

Część II – Anatomia genomów zawiera przegląd rozmaitych typów genomów, jakie występują na naszej planecie. W rozdziale 7 przedstawione są eukariotyczne genomy jądrowe z uwypukleniem genomu ludzkiego, co jest podyktowane znaczeniem jego poznania dla tak wielu obszarów badań, a także tym, że wśród wszystkich zsekwencjonowanych genomów jest on najlepiej poznany. Rozdział 8 zajmuje się sekwencjami genomów organizmów prokariotycznych oraz genomów organellarnych, które zostały tu włączone ze względu na prokariotyczne pochodzenie. W rozdziale 9 opisane są genomy wirusów i ruchomych elementów genetycznych, które włączono w to miejsce, jako że niektóre ich rodzaje są spokrewnione z genomami wirusowymi.

Część III – Ekspresja genomów. W części tej opisano proces wykorzystywania przez komórki informacji zapisanej w jej genomie. W rozdziale 10 przedstawiono niezwykle ważny problem wpływu upakowania DNA w chromatynie na ekspresję różnych części genomu, a w rozdziale 11 opisano kluczową rolę białek wiążących się z DNA w procesie ekspresji określonych części genomu, które są aktywne w określonym czasie. W rozdziale 12 przenosimy się do transkryptomów, przedstawiamy, jak są badane, jaki mają skład i w jaki sposób są syntetyzowane i utrzymywane. W rozdziale 13 znajduje się opis proteomów i proteomiki, a rozdział 14 zawiera podsumowanie tej części książki, czyli opis funkcjonowania genomów w komórkach i organizmach oraz ich odpowiedzi na sygnały dochodzące spoza komórki, a także ich rolę w kierowaniu reakcjami biochemicznym leżącymi u podstaw procesów różnicowania i rozwoju organizmów.

Część IV – Pytanie, jak genomy się replikują i ewoluują łączy zagadnienia replikacji DNA, mutacji i rekombinacji ze stopniową ewolucją genomów na przestrzeni czasu. W rozdziałach 15–17 opisane są molekularne procesy odpowiedzialne za replikację, mutacje, naprawę DNA i rekombinację, podczas gdy w rozdziale 18 przedstawiono sposoby, w jakie te procesy ukształtowały strukturę i genetyczny skład genomów w całym okresie ewolucji. Rozdział 18 kończy się kilkoma przykładami pokazującymi, jak filogenomika molekularna i genomika populacyjna są wykorzystywane w badaniach naukowych i biotechnologii.

Pomoce w nauczaniu

Każdy rozdział zawiera zestaw krótkich pytań i pogłębionych zagadnień, jak również dołączoną listę dalszych lektur. Na końcu książki znajduje się obszerny słownik terminów.

Krótkie pytania wymagają odpowiedzi złożonych z od 50 do 500 słów. Pytania te pokrywają zawartość każdego rozdziału i są sformułowane w prosty sposób. Odpowiedzi na nie można znaleźć, sprawdzając odpowiednią partię tekstu. Student może wykorzystać te pytania w celu systematycznego zapoznania się z treścią rozdziału lub wybrać niektóre z nich w celu sprawdzenia możliwości udzielenia odpowiedzi na określone zagadnienia. Krótkie pytania mogą być też wykorzystywane do przygotowania testów sprawdzających.

Problemy pogłębione wymagają bardziej szczegółowych odpowiedzi. Różnią się charakterem i stopniem trudności. Aby odpowiedzieć na najprostsze z nich, konieczne jest niewiele więcej niż przeglądnięcie literatury. Ich celem jest to, by student rozszerzył wiedzę, nie poprzestając na tym, co pozostaje po zapoznaniu się z Genomami 4. Niektóre pytania wymagają oceny jakiegoś twierdzenia lub hipotezy na podstawie materiałów przedstawionych w tej książce, uzupełnionych ewentualnie o dodatkowe informacje dotyczące danego tematu. Mam nadzieję, że te pytania skłonią do przemyśleń i krytycznych osądów. Niektóre są trudne, a w szeregu przypadkach sensowna odpowiedź na nie jest niemożliwa. Zostały postawione po to, aby stymulować dyskusję i rozważania, które powinny rozszerzyć wiedzę każdego studenta i zmusić go do przemyślenia proponowanych twierdzeń. Rozwiązywania pogłębionych problemów może być podejmowane przez poszczególnych studentów lub stać się przedmiotem dyskusji w grupach.

Dalsze lektury. Ich lista jest zamieszczona na końcu każdego rozdziału i zawiera te artykuły naukowe, artykuły przeglądowe i książki, które uznałem za najlepsze źródło dodatkowych materiałów. Moją intencją przy pisaniu Genomów 4 było, by studenci mogli posłużyć się listą lektur w celu uzyskania dalszych informacji przy pisaniu rozszerzonych esejów lub dysertacji na poszczególne tematy. Zamieszczono tylko te artykuły naukowe, które uznałem za zrozumiałe dla przeciętnego czytelnika tej książki. Położono również nacisk na zamieszczenie artykułów przeglądowych, których kontekst i znaczenie są istotne dla poszczególnych części książki. Lista lektur została podzielona na sekcje odpowiadające zorganizowaniu informacji zawartych w danym rozdziale, a niektórych przypadkach uzupełniłem ją o kilka słów podsumowujących szczególną wartość każdej z nich, tak aby pomóc czytelnikowi w podjęciu decyzji, z którą należy się zapoznać. W niektórych przypadkach lista lektur zawiera URL (ang. Uniform Resource Locator), dostarczający informacji o bazach danych i innych źródłach internetowych, istotnych dla materiału przedstawionego w danym rozdziale.

Słowniczek określa znaczenie każdego terminu, który w tekście jest zaznaczony pogrubionym drukiem, a także wielu terminów, które czytelnik może spotkać w książkach i artykułach wymienionych w liście lektur. Słowniczek pozwala zatem szybko i wygodnie przypomnieć sobie znaczenia terminów stosowanych przy badaniu genomów. Może także pomóc studentom oczekującym na egzamin w upewnieniu się, czy dobrze rozumieją dany termin.

Pomoce dla wykładowców

Przedstawione w książce ilustracje są dostępne na stronie www.garlandscience.com w dwóch wygodnych formatach: PowerPoint i JPEG. Zostały zoptymalizowane w celu przedstawienia ich na komputerze. Ilustracje mogą być wyszukiwane przez wpisanie ich numeru, nazwy lub słów kluczowych znajdujących się w podpisach. Jest również dostępna pomoc w uzyskaniu odpowiedzi na pytania pogłębione na końcu każdego rozdziału.

PODZIĘKOWANIA

Autor i wydawca Genomów 4 gorąco dziękują za wkład w przygotowanie tej edycji następującym recenzentom:

David Baillie, Simon Fraser University; Linda Bonen, University of Ottawa; Hugh Cam, Boston College; Yuri Dubrova, University of Leicester; Bart Eggen, University of Groningen; Robert Fowler, San José State University; Sidney Fu, George Washington University; Adrian Hall, Sheffield Hallam University; Lee Hwei Huih, Universiti Tunku Abdul Rahman; Glyn Jenkins, Aberystwyth University; Julian M. Ketley, University of Leicester; Torsten Kristensen, University of Aarhus; Gerhard May, University of Dundee; Mike McPherson, University of Leeds; Isidoro Metón, Universitat de Barcelona; Gary Ogden, St. Mary’s University; Paul Overvoorde, Macalester College; John Rafferty, University of Sheffield; Andrew Read, University of Manchester; Joaquin Cañizares Sales, Universitat Politècnica de València; Michael Schweizer, Heriot-Watt University; Eric Spana, Duke University; David Studholme, Exeter University; John Taylor, University of Newcastle; Gavin Thomas, University of York; Matthew Upton, Plymouth University; Guido van den Ackerveken, Utrecht University; Vassie Ware, Lehigh University; Wei Zhang, Illinois Institute of Technology.

Przedmowa do czwartego wydania Genomów

Tłumaczenie pierwszego wydania Genomów autorstwa T.A. Browna ukazało się w Polsce w roku 2001. Kolejne wydania wychodziły drukiem w następnych latach, za każdym razem uaktualniane i uzupełniane. Podobnie ma się z obecnym, czwartym wydaniem książki. Sądzę, że jest to bardzo dobry podręcznik genetyki, niemający sobie równego na rynku polskim. Genomy 4 są przeznaczone przede wszystkim dla studentów biologii, medycyny i rolnictwa, ale zostały na tyle przystępnie napisane, że z powodzeniem mogą z nich korzystać maturzyści.

W ostatnich latach nastąpił ogromny postęp w genetyce i całej biologii molekularnej, związany przede wszystkim z udoskonaleniem technik sekwencjonowania DNA. Jeszcze nie tak dawno uzyskanie pełnej sekwencji ludzkiego genomu przekraczało budżet Instytutów Maxa Plancka w Niemczech, obecnie kosztuje to mniej niż 1000 dolarów. Drugim ważnym wydarzeniem było wynalezienie techniki CRISPR-cas (ang. Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats), która pozwala na wprowadzanie dowolnych genów do komórek żywych organizmów lub ich usuwanie. Umożliwia to m.in. określanie funkcji poszczególnych genów. Technika CRISPR-cas jest obecnie podstawową techniką stosowaną w inżynierii genetycznej, z powodzeniem wykorzystywaną do konstruowania szczepów bakterii i drożdży mających zastosowanie w przemyśle chemicznym i farmaceutycznym. Z techniką tą wiąże się wielkie nadzieje, sądzi się bowiem, że otwarta została droga do korekty wad genetycznych. Mimo że wielu uczonych uważa, iż nie jest wystarczająco sprawdzona, by stosować ją w medycynie, w Chinach wykorzystano ją do leczenia, na wczesnym etapie embrionalnym, genetycznie uwarunkowanej dystrofii mięśniowej. Próby w tym kierunku zostały też podjęte w Stanach Zjednoczonych.

T.A. Brown w czwartym wydaniu Genomów ze znawstwem opisuje wszystkie najnowsze „wynalazki” genetyki. Ich charakterystyki nie znajdzie czytelnik w żadnym innym podręczniku dostępnym w Polsce. Sądzę, że ta wartościowa pozycja powinna się znaleźć we wszystkich bibliotekach wyższych uczelni zajmujących się genetyką i biotechnologią.

CZĘŚĆ I
- Jak bada się genomy

1. Genomy, transkryptomy i proteomy

Znane nam życie jest definiowane przez genomy niezliczonych organizmów, z którymi dzielimy naszą planetę. Każdy organizm ma genom zawierający informację biologiczną potrzebną do powstania tego organizmu i utrzymania go przy życiu. Większość genomów, w tym genom człowieka i wszystkich innych komórkowych form życia, jest zbudowana z DNA (kwasu deoksyrybonukleinowego), choć niektóre wirusy mają genom zbudowany z RNA (kwasu rybonukleinowego). DNA i RNA są polimerami składającymi się z łańcuchów monomerycznych podjednostek, zwanych nukleotydami. Każda cząsteczka DNA składa się z dwóch owiniętych wokół siebie polinukleotydów tworzących podwójną helisę, w obrębie której dwie nici trzymają się razem dzięki wiązaniom chemicznym łączącym dwa sąsiadujące nukleotydy w strukturę zwaną parą zasad.

Genom człowieka, który jest typowym genomem zwierząt wielokomórkowych, składa się z dwóch odrębnych części (rys. 1.1):

Rys. 1.1. Jądrowe i mitochondrialne składniki genomu człowieka

• genomu jądrowego, składającego się z 3 235 000 000 par zasad DNA, podzielonego na 24 cząsteczki; długość najkrótszej z nich wynosi 48 000 000, a najdłuższej 250 000 000 par zasad, każda z nich tworzy oddzielny chromosom; te 24 chromosomy to 22 autosomy i dwa chromosomy płci, X i Y – w sumie ludzki genom jądrowy zawiera mniej więcej 45 500 genów;

• genomu mitochondrialnego, kolistej cząsteczki DNA o długości 16 569 nukleotydów, która w ilości do 10 kopii znajduje się w organellach wytwarzających energię, zwanych mitochondriami – ludzki genom mitochondrialny zawiera tylko 37 genów.

Każda z ok. 1013 komórek ciała dorosłego człowieka ma swoją własną kopię lub kopie genomu. Jedynymi wyjątkami są niektóre rodzaje komórek, jak czerwone krwinki, które w stanie pełnego zróżnicowania nie mają jądra. Większość komórek jest diploidalna, czyli ma po dwie kopie każdego autosomu plus dwa chromosomy płci: XX u kobiet, a XY u mężczyzn – łącznie 46 chromosomów. Tak jest w przypadku komórek somatycznych, w przeciwieństwie do komórek płciowych, czyli gamet, które są haploidalne i mają tylko 23 chromosomy – po jednym z każdej pary autosomów i jeden chromosom płci. Każda komórka ma również wiele kopii genomu mitochondrialnego: 2 000–7 000 kopii w komórkach somatycznych, takich jak komórki serca i wątroby, oraz ponad 100 000 kopii w każdym oocycie.

Genom jest magazynem informacji biologicznej, jednak sam nie może przekazać tej informacji komórce. Wykorzystanie informacji biologicznej zawartej w genomie wymaga skoordynowanej aktywności enzymów i innych białek, które biorą udział w złożonych reakcjach biochemicznych prowadzących do ekspresji genomu (rys. 1.2). Początkowym produktem ekspresji genomu jest transkryptom, zbiór cząsteczek RNA pochodzących z genów aktywnych w komórce w danym momencie. Transkryptom powstaje w procesie transkrypcji – kopiowania (dosłownie: przepisywania) pojedynczych genów na cząsteczki RNA. Następnym produktem ekspresji genomu jest proteom – repertuar białek komórki, określający rodzaj reakcji biochemicznych, które dana komórka może przeprowadzać. Białka tworzące proteom są syntetyzowane w procesie translacji (dosłownie: tłumaczenia, przekładu z) niektórych pojedynczych cząsteczek RNA obecnych w transkryptomie.

Rys. 1.2. Ekspresja genomu. Genom określa transkryptom, a transkryptom określa proteom

Niniejsza książka opisuje genomy i ekspresję genomów. Wyjaśnia, w jaki sposób bada się genomy (część 1), jak są one zorganizowane (część 2), jak funkcjonują (część 3) oraz jak się replikują i ewoluują (część 4). Aż do niedawna nie było możliwości napisania takiej książki. Od lat 50. XX w. biolodzy molekularni badali pojedyncze geny lub małe grupy genów. Dzięki tym badaniom powstała bogata wiedza dotycząca działania genów. Dopiero przez ostatnie kilka lat dostępne są techniki umożliwiające badanie całych genomów. Pojedyncze geny są nadal intensywnie badane, jednak dane dotyczące poszczególnych genów są teraz interpretowane w kontekście genomu jako całości. Ten nowy, szerszy aspekt odnosi się nie tylko do genomów, lecz także do całej biochemii i biologii komórki. Nie wystarcza już zrozumienie pojedynczego szlaku biochemicznego czy procesu wewnątrzkomórkowego. Obecnie wyzwaniem jest biologia systemów, która stara się powiązać te szlaki i procesy w sieć opisującą całościowe funkcjonowanie żyjącej komórki i żyjącego organizmu.

Niniejsza książka prowadzi przez naszą wiedzę o genomach i pokazuje, że ta ekscytująca dziedzina badań leży u podstaw pogłębiającego się zrozumienia działania układów biologicznych. Na początek musimy zwrócić uwagę na podstawowe prawa biologii molekularnej przez omówienie głównych cech trzech typów cząsteczek biologicznych związanych z genomem i jego ekspresją: DNA, RNA i białek.

1.1. DNA

DNA odkrył w 1869 r. Johann Friedrich Miescher, szwajcarski biochemik pracujący w Tybindze w Niemczech. Pierwsze ekstrakty otrzymane przez Mieschera z ludzkich białych krwinek były nieoczyszczoną mieszaniną DNA i białek chromosomowych. W następnych latach Miescher przeniósł się do Bazylei w Szwajcarii, gdzie obecnie znajduje się instytut badawczy jego imienia. Otrzymał tam czyste próbki kwasu nukleinowego ze spermy łososia. Testy chemiczne przeprowadzone przez Mieschera wykazały, że DNA jest kwasem bogatym w fosfor, oraz sugerowały, że pojedyncze cząsteczki są bardzo duże. Jednak dopiero w latach 30., gdy do badania DNA zastosowano metody biofizyczne, w pełni oszacowano olbrzymią długość polimerycznych łańcuchów.

Geny zbudowane są z DNA

Fakt, że geny zbudowane są z DNA, jest dzisiaj tak dobrze znany, iż trudno uzmysłowić sobie, że przez 75 lat od jego odkrycia nie podejrzewano, jaka jest jego prawdziwa rola. Dopiero W.S. Sutton w 1903 r. zdał sobie sprawę, że dziedziczenie genów odpowiada zachowaniu się chromosomów w czasie podziałów komórki. Obserwacja ta doprowadziła do zaproponowania teorii chromosomowej, mówiącej, że geny znajdują się w chromosomach. Badania komórek metodami cytochemicznymi, wykorzystującymi barwniki specyficznie wiążące się tylko z jednym typem cząsteczek, wykazały, że chromosomy zawierają mniej więcej równe ilości DNA i białek. W tym czasie biolodzy uświadomili sobie, że muszą istnieć miliony różnych genów i dlatego materiał genetyczny musi występować w wielu różnych formach. Wydawało się, że tego wymagania nie spełnia DNA, ponieważ na początku XX w. sądzono, iż wszystkie cząsteczki DNA są takie same. Z drugiej strony wiedziano, że białka są bardzo zmiennymi, polimerycznymi cząsteczkami, z których każda składa się z różnej kombinacji dwudziestu chemicznie różnych aminokwasowych monomerów (sekcja 1.3.1). Dlatego uważano, że geny są zbudowane z białek, a nie z DNA.

Błędy w rozumieniu struktury DNA pokutowały do późnych lat 30., kiedy to ustalono, że DNA, podobnie jak białka, cechuje ogromna zmienność. Przypuszczenie, że białka są materiałem genetycznym, pozostawało początkowo silne, ale ostatecznie wykluczono je na podstawie dwóch ważnych doświadczeń.

• Oswald Avery, Colin MacLeod i Maclyn McCarty wykazali, że DNA jest aktywnym składnikiem czynnika transformującego – ekstraktu z komórek bakteryjnych, który po zmieszaniu z niezjadliwym szczepem Streptococcus pneumoniae przekształcał te bakterie w szczep wirulentny, wywołujący zapalenie płuc po wszczepieniu myszom (rys. 1.3A). W 1944 r., kiedy opublikowano wyniki tego doświadczenia, tylko kilku mikrobiologów zdało sobie sprawę, że transformacja obejmuje przeniesienie genów z ekstraktu komórkowego do żywych bakterii. Jednak gdy zaakceptowano ten fakt, prawdziwe znaczenie „eksperymentu Avery’ego” stało się jasne: geny bakteryjne muszą być zbudowane z DNA.

• Alfred Hershey i Martha Chase zastosowali znakowanie izotopami, by wykazać, że gdy hodowle bakteryjne zainfekuje się bakteriofagami (rodzajem wirusów, zwanych również fagami), to głównym składnikiem bakteriofagów wnikającym do komórki jest DNA (rys. 1.3B). Była to istotna obserwacja, ponieważ wiedziano już, że w czasie cyklu infekcyjnego geny infekujących bakteriofagów kierują syntezą nowych bakteriofagów oraz że ta synteza zachodzi w bakteriach. Jeżeli DNA jest jedyną cząsteczką infekujących bakteriofagów wnikającą do komórki, to wynika z tego, że geny tych bakteriofagów muszą być zbudowane z DNA.

Rys. 1.3. Dwa eksperymenty, które sugerowały, że geny są zbudowane z DNA. (A) Avery z kolegami wykazali, że czynnik transformujący jest zbudowany z DNA. Dwie górne części pokazują, co się dzieje, gdy myszy zostaną zainfekowane niezjadliwymi bakteriami Streptococcus pneumoniae, samymi lub z czynnikiem transformującym – ekstraktem komórkowym z wirulentnego szczepu S. pneumoniae. Gdy dodawany jest czynnik transformujący, mysz umiera, ponieważ geny w czynniku transformującym przekształcają niezjadliwe bakterie w formę wirulentną. Takie wirulentne bakterie można było następnie wyizolować z płuc martwej myszy. Dolna część pokazuje, że traktowanie czynnika transformującego proteazą lub rybonukleazą nie daje żadnych efektów, inaktywuje go jednak deoksyrybonukleaza. (B) W doświadczeniu Hersheya i Chase wykorzystano bakteriofagi T2. Zbudowane są one z cząsteczki DNA zawartej w kapsydzie białkowym, złożonym z główki i ogonka, z włóknami umożliwiającymi bakteriofagowi przyłączenie się do powierzchni bakterii i wstrzyknięcie genów do komórki. DNA bakteriofagów wyznakowano ³²P, a białka ³⁵S. Kilka minut po infekcji hodowlę wytrząsano w wytrząsarce, by odłączyć puste cząsteczki fagowe od powierzchni komórki. Następnie hodowlę wirowano, w wyniku czego na dnie probówki otrzymywano osad z bakterii z genami fagowymi, a lżejsze cząstki fagowe pozostawały w supernatancie. Hershey i Chase wykazali, że osad bakteryjny zawierał 70% składników faga wyznakowanych ³²P (DNA) i tylko 20% materiału wyznakowanego ³⁵S (białka fagowe). W kolejnym doświadczeniu, niepokazanym tutaj, Hershey i Chase wykazali, że nowe fagi, powstałe po zakończeniu cyklu infekcyjnego, zawierały mniej niż 1% białek fagów rodzicielskich. Więcej szczegółów na temat cyklu infekcyjnego bakteriofagów na rys. 2.27.

Chociaż z naszej perspektywy te dwa doświadczenia dostarczają podstawowych danych, mówiących, że geny są zbudowane z DNA, jednak w tamtych czasach nie było łatwo przekonać biologów. Obydwa eksperymenty miały ograniczenia dające sceptykom możliwość argumentowania, że białka jednak mogą być materiałem genetycznym. Na przykład wątpiono w specyficzność deoksyrybonukleazy – enzymu, którego Avery z kolegami używali do inaktywacji czynnika transformującego. Wynik ten (główna część dowodu, że czynnik transformujący to DNA) byłby nieważny, gdyby, co wydawało się możliwe, enzym ten zawierał choć śladowe ilości zanieczyszczającej proteazy i tym samym mógłby również degradować białka. Również eksperyment z bakteriofagami nie był rozstrzygający, co Hershey i Chase podkreślili, publikując swoje wyniki: „Nasze doświadczenia pokazują, że jest możliwy fizyczny podział faga T2 na część genetyczną i niegenetyczną… Na chemiczną identyfikację części genetycznej musimy jednak poczekać, dopóki nie będzie znana odpowiedź na kilka pytań”. Z perspektywy czasu te dwa eksperymenty są ważne wcale nie z powodu wniosków, jakie z nich wyciągnięto, ale dlatego, że uświadomiły biologom, iż DNA może być materiałem genetycznym i dlatego warto prowadzić nad nim badania. Właśnie to zainspirowało Watsona i Cricka do pracy nad DNA. Ich odkrycie struktury podwójnej helisy (linii śrubowej), dającej odpowiedź na zagadkowe pytanie o sposób replikacji genów, ostatecznie przekonało świat naukowy o tym, że geny zbudowane są z DNA.

DNA jest polimerem zbudowanym z nukleotydów

Nazwiska Jamesa Watsona i Francisa Cricka są tak mocno związane z DNA, że zwykle nie pamięta się o tym, iż w październiku 1951 r., kiedy zaczynali współpracę, szczegółowa struktura polimeru DNA była już znana. Ich wkładem nie jest określenie struktury DNA per se, ale wykazanie, że w żywych komórkach dwa łańcuchy DNA są zwinięte, tworząc podwójną helisę. Dlatego musimy najpierw zapoznać się z tym, co Watson i Crick wiedzieli, zanim rozpoczęli swoje badania.

DNA jest liniowym, nierozgałęzionym polimerem, zbudowanym z monomerycznych podjednostek – czterech różnych chemicznie nukleotydów, które mogą być połączone w różnej kolejności, tworząc łańcuchy składające się z setek, tysięcy, a nawet milionów jednostek. Każdy z nukleotydów w polimerze DNA zawiera trzy składniki (patrz rys. 1.4):

Rys. 1.4. Struktura nukleotydu. (A) Ogólna struktura deoksyrybonukleotydu, rodzaju nukleotydu występującego w DNA. (B) Cztery zasady azotowe występujące w deoksyrybonukleotydach

• 2'-deoksyrybozę, która jest pentozą, rodzajem cukru zawierającym pięć atomów węgla; atomy węgla noszą numery 1' (jeden prim), 2' itp.; nazwa „2’-deoksyryboza” oznacza, że cukier ten jest pochodną rybozy, w której grupa hydroksylowa (—OH) połączona z atomem węgla 2' została zastąpiona przez wodór (—H);

• zasadę azotową – cytozynę lub tyminę (jednopierścieniową pirymidynę) albo adeninę lub guaninę (dwupierścieniową purynę); zasada azotowa jest połączona z resztą cukrową wiązaniem β-N-glikozydowym, łączącym atom węgla 1' reszty cukrowej z atomem azotu numer 1 pirymidyny lub atomem azotu numer 9 puryny;

• grupę fosforanową, składającą się z jednej, dwóch lub trzech połączonych reszt fosforanowych związanych z atomem węgla 5' reszty cukrowej; reszty fosforanowe oznaczono symbolami α, β i γ; reszta α-fosforanowa bezpośrednio łączy się z resztą cukrową.

Cząsteczka składająca się z cukru i zasady azotowej nazywana jest nukleozydem; przyłączenie reszty fosforanowej zamienia ją w nukleotyd. Komórki zawierają nukleotydy z jedną, dwiema lub trzema resztami fosforanowymi, ale jako substraty w procesie syntezy DNA wykorzystywane są tylko trifosforany nukleozydów. Pełne chemiczne nazwy czterech nukleotydów, które w reakcji polimeryzacji tworzą DNA, to:

• 2'-deoksyadenozyno-5'-trifosforan,

• 2'-deoksycytydyno-5'-trifosforan,

• 2'-deoksyguanozyno-5'-trifosforan,

• 2'-deoksytymidyno-5'-trifosforan.

Skróty nazw tych czterech nukleotydów to odpowiednio: dATP, dCTP, dGTP i dTTP lub, gdy mówimy o sekwencji DNA, A, C, G i T.

W cząsteczce polinukleotydu pojedyncze nukleotydy połączone są wiązaniem fosfodiestrowym, łączącym atomy węgla 5' i 3' (patrz rys. 1.5). Struktura tego wiązania wskazuje, że w czasie reakcji polimeryzacji następuje usunięcie z nukleotydu dwóch zewnętrznych grup fosforanowych (β i γ) i zastąpienie nim grupy hydroksylowej połączonej z atomem węgla 3' następnego nukleotydu (rys. 1.6). Należy zwrócić uwagę, że dwa końce polinukleotydu są chemicznie różne. Na jednym znajduje się grupa trifosforanowa połączona z atomem węgla 5' (koniec 5' lub 5'P), a na drugim – grupa hydroksylowa połączona z atomem węgla 3' (koniec 3' lub 3'OH). Oznacza to, że polinukleotyd ma określoną orientację chemiczną, zapisywaną jako 5'→3' (w dół na rys. 1.5) lub 3'→5' (w górę na rys. 1.5). Ważną konsekwencją polarności (biegunowości) wiązania fosfodiestrowego jest to, że reakcja chemiczna, która wydłużałaby polimer DNA w kierunku 5'→3', jest różna od reakcji, w wyniku której następowałoby wydłużanie w kierunku 3'→5'. W organizmach żywych występują polimerazy DNA zdolne do przeprowadzania reakcji tylko w kierunku 5'→3', co powoduje dodatkowe znaczące komplikacje w procesie replikacji (tworzenia wiernej kopii) dwuniciowej cząsteczki DNA (sekcja 15.3).

Rys. 1.5. Krótki polinukleotyd DNA z zaznaczoną strukturą wiązania fosfodiestrowego. Zwróć uwagę, że dwa końce polinukleotydu są chemicznie różne

Rys. 1.6. Synteza polinukleotydu DNA następuje w wyniku reakcji polimeryzacji. Reakcja syntezy zachodzi w kierunku 5′→3′. Nowo dodawany nukleotyd jest przyłączany do węgla 3’ na końcu istniejącego polinukleotydu. Reszty fosforanowe β i γ są usuwane z dodawanego nukleotydu w formie cząsteczki pirofosforanu

Przed rokiem 1950 wiele różnych dowodów wskazywało, że cząsteczki DNA w komórce zbudowane są z dwóch lub więcej polinukleotydów w jakiś sposób ze sobą połączonych. Wyjaśnienie natury tej struktury mogło pomóc zrozumieć, jak działają geny. Dlatego Watson i Crick, jak też i inni badacze, starali się rozwikłać strukturę DNA. Jak pisze Watson w książce The Double Helix (1968, tłum. pol. Podwójna spirala 1974), ich praca była desperackim wyścigiem z amerykańskim biochemikiem Linusem Paulingiem, który początkowo zaproponował błędny model potrójnej helisy. Dzięki temu Watson i Crick zyskali czas potrzebny do ukończenia struktury podwójnej helisy. Trudno dzisiaj oddzielić fakty od fikcji, szczególnie jeśli chodzi o rolę, jaką odegrała Rosalind Franklin. Jej badania z zastosowaniem dyfrakcji rentgenowskiej dostarczyły olbrzymiej ilości danych doświadczalnych, potwierdzających model podwójnej helisy. Ona sama była bardzo bliska rozwikłania tej struktury. Jedno jest pewne – odkrycie podwójnej helisy przez Watsona i Cricka w sobotę 7 marca 1953 r. było najważniejszym wydarzeniem w biologii XX w.

Odkrycie podwójnej helisy można uważać za jeden z pierwszych multidyscyplinarnych biologicznych projektów badawczych. By wywnioskować, jaka jest struktura podwójnej helisy, Watson i Crick wykorzystali cztery rodzaje danych.

1. Wykorzystanie różnego rodzaju danych biofizycznych umożliwiło wydedukowanie, jakie są podstawowe cechy tej struktury. Zawartość wody we włóknach DNA była szczególnie istotna, ponieważ umożliwiała określenie gęstości włókna. Liczba łańcuchów w helisie oraz odległość między nukleotydami musiała być zgodna z gęstością włókna. Model potrójnej helisy Paulinga był oparty na błędnych pomiarach gęstości, sugerujących, że cząsteczka DNA ma strukturę upakowaną w większym stopniu, niż to ma miejsce w rzeczywistości.

2. Wzory dyfrakcji promieni rentgenowskich (sekcja 11.1), w większości otrzymane przez Rosalind Franklin, sugerowały szczegóły helikalnej struktury DNA (rys. 1.7).

Rys. 1.7. Wykonany przez Rosalind Franklin rentgenogram dyfrakcyjny nr 51, otrzymany przy użyciu włókien DNA. Kształt krzyża świadczy o tym, że DNA ma strukturę helikalną. Stopień zaczernienia wewnątrz rombowej powierzchni nad, pod i po obu stronach krzyża wskazuje, że szkielet cukrowo-fosforanowy jest położony na zewnątrz helisy (patrz rys. 1.9). Na podstawie położenia różnych plam tworzących ramiona krzyża można obliczyć wymiary cząsteczki, takie jak średnica, przyrost długości helisy na parę zasad i skok helisy (patrz tab. 1.1). Brakujące plamy (zaznaczone strzałkami przerwy w każdym z ramion krzyża) wskazują na względne ułożenie dwóch polinukleotydów. To dzięki tym brakującym plamom Watson i Crick doszli do wniosku, że na zewnętrznej powierzchni helisy znajdują się dwa rowki o różnej głębokości (patrz rys. 1.9) (przedruk z R. Franklin, R.G. Gosling (1953), Nature 171:740-741, za zgodą Macmillan Publishers Ltd.)

3. Proporcje ilościowe zasad azotowych, odkryte przez Erwina Chargaffa z Uniwersytetu Columbia w Nowym Jorku, umożliwiły wydedukowanie, w jaki sposób polinukleotydy są połączone w podwójnej helisie. Chargaff prowadził długotrwałe serie chromatograficznych badań próbek DNA z różnych źródeł. Wykazał, że chociaż organizmy różnią się zawartością poszczególnych zasad, jednak molowa ilość adeniny jest zawsze równa ilości tyminy, a ilość guaniny ilości cytozyny (rys. 1.8). Takie proporcje ilościowe zasad doprowadziły do sformułowania praw łączenia się zasad w pary, co było podstawą odkrycia struktury podwójnej helisy.

Rys. 1.8. Doświadczenie Chargaffa pokazujące stosunek ilościowy zasad azotowych w DNA. Z różnych organizmów ekstrahowano DNA i traktowano go kwasem, by poddać hydrolizie wiązania fosfodiestrowe i uwolnić wolne nukleotydy. Ilość każdego nukleotydu oszacowano chromatograficznie. Dane pokazują wyniki uzyskane przez Chargaffa. Wyniki te wykazały, że w granicach błędu doświadczalnego ilość adeniny jest równa ilości tyminy, a ilość guaniny – ilości cytozyny

4. Konstruowanie modeli (w skali) możliwych struktur DNA było jedyną znaczącą metodą wprowadzoną przez samych Watsona i Cricka. Takie modele umożliwiały sprawdzanie wzajemnego położenia różnych atomów, by upewnić się, że pary zasad tworzące wiązanie nie są za bardzo od siebie oddalone oraz że inne atomy nie są na tyle blisko, by na siebie oddziaływać.

Łączenie się zasad w pary i asocjacja warstwowa stabilizują podwójna helisę

Podwójna helisa jest prawoskrętna. Oznacza to, że gdyby była spiralnymi schodami, po których wspinalibyśmy się w górę, to zewnętrzna poręcz schodów byłaby po naszej prawej stronie. Dwa łańcuchy są przeciwnie skierowane (rys. 1.9A). Helisę stabilizują dwa rodzaje oddziaływań chemicznych.

Rys. 1.9. Struktura podwójnej helisy DNA. (A) Dwa schematy podwójnej helisy. Po lewej – struktura helisy, w której szkielet cukrowo-fosforanowy każdego polinukleotydu przedstawiono jako szarą wstążkę, z parami zasad w kolorze zielonym. Po prawej – struktura chemiczna trzech par zasad (B) A tworzy parę z T, a G z C. Przedstawiono ogólny schemat zasad, wiązania wodorowe zaznaczono przerywaną linią. Zwróć uwagę, że para G · C łączy się za pomocą trzech wiązań wodorowych, podczas gdy para A · T za pomocą tylko dwóch wiązań wodorowych

1. Łączenie się zasad w pary (parowanie zasad) polega na utworzeniu wiązań wodorowych między adeniną w jednym a tyminą w drugim łańcuchu lub między cytozyną w jednym a guaniną w drugim łańcuchu (rys. 1.9B). Wiązania wodorowe są słabymi oddziaływaniami elektrostatycznymi między atomem o ładunku ujemnym (jak tlen czy azot) a atomem wodoru związanym z innym atomem elektroujemnym. Wiązania wodorowe są dłuższe i dużo słabsze od wiązań kowalencyjnych. Typowa dla nich energia wiązania to 8–29 kJ·mol–1 w temperaturze 25°C, w porównaniu z energią do 348 kJ·mol–1 dla wiązania kowalencyjnego między dwoma atomami węgla. Wiązania wodorowe stabilizują nie tylko strukturę podwójnej helisy DNA, lecz także struktury drugorzędowe w białkach. Dwie kombinacje par zasad, A łączy się z T i G łączy się z C, tłumaczą proporcje ilościowe zasad odkryte przez Chargaffa. Są to jedyne dopuszczalne pary zasad. Ograniczenie to wynika częściowo z geometrii zasad azotowych i względnego położenia atomów, które mogą uczestniczyć w wytworzeniu wiązania wodorowego. Poza tym tylko puryna i pirymidyna mogą łączyć się ze sobą. Para puryna––puryna byłaby zbyt duża, by zmieścić się wewnątrz helisy, a para pirymidyna–pirymidyna byłaby zbyt mała.

2. Asocjacja warstwowa (oddziaływania warstwowe) jest związana z siłami przyciągania między sąsiednimi parami zasad i zwiększa stabilność podwójnej helisy po połączeniu się zasad w pary. Asocjacja warstwowa nazywana jest czasami oddziaływaniami typu π–π, ponieważ sądzi się, że uczestniczą w nich elektrony p, tworzące wiązania podwójne w strukturach puryny i pirymidyny. Jednak hipoteza ta jest obecnie kwestionowana i prowadzone są badania testujące możliwy udział jakiegoś rodzaju oddziaływań elektrostatycznych w asocjacji warstwowej.

Obydwa rodzaje oddziaływań, zarówno łączenie się zasad w pary, jak i asocjacja warstwowa, są ważne w utrzymaniu razem dwóch polinukleotydów. Zjawisko łączenia się zasad w pary ma również szczególne znaczenie ze względu na jego implikacje biologiczne. Z ograniczenia, że A może łączyć się tylko z T, a G tylko z C, wynika, że w procesie replikacji DNA może powstać dokładna kopia cząsteczki rodzicielskiej. W procesie tym sekwencja istniejącej nici dyktuje sekwencję nowej nici. Mechanizm ten nazwano syntezą DNA zależną od matrycy; jest ona przeprowadzana przez wszystkie komórkowe polimerazy DNA (sekcja 2.1). Łączenie się zasad w pary jest prostym i eleganckim mechanizmem umożliwiającym replikację cząsteczek DNA. Dlatego bardzo szybko po opublikowaniu struktury podwójnej helisy przez Watsona i Cricka wszyscy biolodzy byli pewni, że geny są naprawdę zbudowane z DNA.

Podwójna helisa jest strukturą elastyczną

Podwójna helisa opisana przez Watsona i Cricka, pokazana na rys. 1.9A, nazywana jest formą B DNA lub B-DNA. Ma charakterystyczne wymiary:

• średnicę helisy – 2,37 nm;

• przyrost długości helisy na parę zasad – 0,34 nm;

• skok helisy (odcinek przypadający na jeden skręt helisy) – 3,4 nm, co odpowiada dziesięciu parom zasad na skręt.

Przyjęto, że DNA w komórce występuje głównie w formie B. Dzisiaj jest jednak oczywiste, że cząsteczki genomowego DNA nie mają jednorodnej struktury. Wynika to z tego, że nukleotydy w helisie charakteryzują się elastycznością, która pozwala ich cząsteczkom przybierać nieco odmienne kształty. Aby mogła zmienić się konformacja cząsteczki, musi się nieco zmienić względne położenie atomów w nukleotydzie. Istnieje wiele możliwości, ale do najważniejszych zmian konformacyjnych należą:

• rotacja wokół wiązania β-N-glikozydowego, która zmienia orientację zasady w stosunku do reszty cukrowej; dwie możliwe orientacje nazywane są konformacją anti i konformacją syn (rys. 1.10A); rotacja zasady wpływa na względne położenie dwóch polinukleotydów;

Rys. 1.10. Zmiana konfiguracji przestrzennej nukleotydów wpływa na konformację podwójnej helisy.(A) Konformacja anti i konformacja syn deoksyadenozyny. Te dwie konformacje różnią się orientacją zasady azotowej w stosunku do reszty cukrowej nukleozydu. Rotacja wokół wiązania β-N-glikozydowego przekształca jedną konformację w drugą. Pozostałe trzy nukleozydy również występuja w konformacji anti lub syn. (B) Konformacja cukrów (ang. sugar pucker). Położenie atomów węgla w pierścieniu cukru w konfiguracji przestrzennej C2′-endo i C3′-endo

• zmiany konformacji cukrów (ang. sugar pucker) wpływają na ich trójwymiarowy kształt; pierścień rybozy, wchodzącej w skład nukleotydu, nie jest płaski – widok tej struktury z boku pokazuje, że jeden lub dwa atomy węgla są zlokalizowane powyżej lub poniżej płaszczyzny pierścienia cukrowego (rys. 1.10B); w konfiguracji C2'-endo atom węgla 2' położony jest powyżej tej płaszczyzny, atom węgla 3' tuż poniżej, natomiast w konformacji C3'-endo, atom węgla 3' jest położony powyżej, a atom węgla 2' poniżej; ponieważ atom węgla 3' wchodzi w skład wiązania fosfodiestrowego łączącego cukier z sąsiednim nukleotydem, te dwie konfiguracje pierścienia cukru różnie wpływają na konformację szkieletu cukrowo-fosforanowego.

Zmiany konformacyjne, wynikające z rotacji wokół wiązania β-N-glikozydowego oraz zmian w konformacji pierścienia cukrowego, mogą prowadzić do dużych zmian w ogólnej strukturze helisy. Od lat 50. wiadomo, że wymiary podwójnej helisy ulegają zmianie, gdy zmienia się względna wilgotność włókien zawierających cząsteczki DNA. Na przykład zmodyfikowana wersja podwójnej helisy, zwana A-DNA, ma średnicę 2,55 nm, przyrost długości helisy na parę zasad wynosi 0,23 nm, a skok helisy – 2,5 nm, co odpowiada 11 parom zasad na skręt (tab. 1.1). Podobnie jak forma B, forma A jest prawoskrętną helisą, w której orientacja zasady w stosunku do reszty cukrowej odpowiada konformacji anti. Podstawowa różnica między formami A i B dotyczy konformacji cukrów. Pierścienie cukrowe w B-DNA występują w konfiguracji C2'-endo, a w A-DNA w konfiguracji C3'-endo. Inne prawoskrętne wersje podwójnej helisy to: B'-, C-, C'-, Cʺ-, D-, E- i T-DNA.

Tabela 1.1. Cechy różnych form podwójnej helisy DNA

Cecha

A-DNA

B-DNA

Z-DNA

Typ helisy

prawoskrętna

prawoskrętna

lewoskrętna

Średnica helisy (nm)

2,55

2,37

1,84

Odległość między sąsiednimi parami zasad (nm)

0,23

0,34

0,38

Przyrost długości na skręt helisy (skok) (nm)

2,5

3,4

4,6

Liczba zasad na skręt

11

10

12

Orientacja zasady azotowej

anti

anti

mieszana

Konformacja cukru

C3'-endo

C2'-endo

mieszana

Możliwa jest również bardziej drastyczna zmiana konformacji, prowadząca do powstania lewoskrętnej formy Z-DNA, w której szkielet cukrowo-fosforanowy ma nieregularny, zygzakowaty kształt. Z-DNA jest ciaśniej zwiniętą wersją podwójnej helisy o skoku 12 par zasad na skręt i średnicy tylko 1,84 nm (tab. 1.1). Wiadomo, że podwójna helisa ma taką formę w rejonach zawierających powtórzone motywy GC, tzn. w takich, w których sekwencja obu nici to ...GCGCGCGC..., gdzie wszystkie nukleotydy guaninowe mają konformację syn i C3'-endo, a wszystkie nukleotydy cytozynowe konformację anti i C2'-endo.

Same dane dotyczące wymiarów różnych form podwójnej helisy nie odzwierciedlają najbardziej znaczącej różnicy między nimi. Istotna nie jest średnica czy skok helisy, ale to, w jakim stopniu wewnętrzne obszary helisy są dostępne z jej powierzchni. Rysunek 1.9A pokazuje, że powierzchnia formy B-DNA nie jest całkowicie gładka, ale że spiralnie biegną wzdłuż niej dwa rowki. Jeden z nich, stosunkowo szeroki i głęboki, nazywany jest większym rowkiem. Drugi, węższy i płytszy, to mniejszy rowek. A-DNA również ma dwa rowki, jednak w tej konformacji większy rowek jest głębszy, a mniejszy rowek płytszy niż w B-DNA (rys. 1.9). Forma Z-DNA jest zdecydowanie inna – większy rowek praktycznie nie istnieje, a mniejszy jest bardzo wąski i głęboki. W każdej z form DNA część powierzchni wewnętrznej przynajmniej jednego rowka jest utworzona przez grupy chemiczne zasad azotowych. Z rozdziału 11 dowiemy się, że ekspresja informacji genetycznej zawartej w genomie zachodzi za pośrednictwem białek wiążących DNA, które wiążą się do podwójnej helisy i regulują aktywność znajdujących się w niej genów. By spełniać swoją funkcję, każde białko wiążące DNA musi specyficznie wiązać się do sekwencji położonej obok genu, którego aktywność reguluje. Jest to możliwe, gdyż białko wiążące DNA oddziałuje z dnem rowka i może z mniejszą lub większą dokładnością „czytać” sekwencję nukleotydową bez otwierania helisy, a więc bez rozrywania wiązań łączących pary zasad. Wynika stąd, że białka wiążące DNA, które mają strukturę umożliwiającą im rozpoznanie specyficznej sekwencji nukleotydów, np. w formie B DNA, mogą nie być zdolne do rozpoznania tej samej sekwencji w cząsteczce DNA o innej konformacji. Jak dowiemy się z sekcji 11.3, zmiany konformacyjne wzdłuż cząsteczki DNA oraz polimorfizm strukturalny wynikający z sekwencji nukleotydów mogą determinować specyficzność oddziaływań między genomem i białkami wiążącymi DNA.

Rys. 1.11. Modele form A, B i Z podwójnej helisy. Większy i mniejszy rowek na powierzchni cząsteczek oznaczono odpowiednio literami M i m (dzięki uprzejmości R.S. Wheelera, na licencji GFDL 1.2)

1.2. RNA i transkryptom

Początkowym produktem ekspresji genomu jest transkryptom (patrz rys. 1.2) – zbiór cząsteczek RNA pochodzących od genów aktywnych w komórce w danym momencie. Cząsteczki RNA tworzące transkryptom są syntetyzowane w procesie transkrypcji (przepisywania z DNA na RNA). W tej sekcji poznamy strukturę RNA i przyjrzymy się dokładniej różnym rodzajom cząsteczek RNA występującym w komórce.

RNA jest drugim rodzajem polinukleotydu

RNA jest polinukleotydem podobnym do DNA, ale różnią go dwie istotne cechy chemiczne (rys. 1.12). Po pierwsze cukrem wchodzącym w skład RNA jest ryboza, po drugie RNA zawiera uracyl zamiast tyminy. Dlatego cztery nukleotydy, substraty w syntezie RNA, to:

• adenozyno-5'-trifosforan,

• cytydyno-5'-trifosforan,

• guanozyno-5'-trifosforan,

• urydyno-5'-trifosforan.

Skróty nazw tych czterech nukleotydów to odpowiednio: ATP, CTP, GTP i UTP lub A, C, G i U.

Rys. 1.12. Różnice struktury chemicznej DNA i RNA. (A) RNA jest zbudowany z rybonukleotydów, w skład których wchodzi cukier ryboza, a nie 2′-deoksyryboza. W cząsteczce rybozy do węgla 2′ przyłączona jest grupa hydroksylowa, a nie atom wodoru. (B) RNA zamiast tyminy zawiera pirymidynę o nazwie uracyl

W polinukleotydzie RNA, podobnie jak w DNA, występują wiązania 3'–5' fosfodiestrowe. Są one jednak mniej stabilne niż w DNA, co wynika pośrednio z obecności grupy hydroksylowej połączonej z atomem węgla 2' reszty cukrowej. Cząsteczki RNA rzadko mają długość większą niż kilka tysięcy nukleotydów. Chociaż występują w nich liczne rodzaje wiązań wewnątrzcząsteczkowych, powstałych dzięki łączeniu się zasad w pary (patrz np. rys. 5), jednak w większości cząsteczki RNA są jedno-, a nie dwuniciowe.

Enzym odpowiedzialny za transkrypcję DNA na RNA nazwano polimerazą RNA zależną od DNA. Jak wynika z nazwy, przeprowadza on reakcję enzymatyczną polimeryzacji RNA z rybonukleotydów, która jest zależna od DNA. Oznacza to, że sekwencja nukleotydów w cząsteczce DNA – matrycy dyktuje sekwencję nukleotydów w syntetyzowanej cząsteczce RNA (rys. 1.13). Nazwę enzymu można skrócić do: polimeraza RNA. Należy jednak pamiętać, by z kontekstu wynikało, że chodzi o ten właśnie enzym i nie mylić go z polimerazą RNA zależną od RNA, enzymem biorącym udział w replikacji i ekspresji genomów niektórych wirusów. Od strony chemicznej zależna od matrycy synteza RNA odpowiada syntezie DNA (patrz rys. 1.6). Rybonukleotydy są dodawane jeden po drugim do wydłużającego się końca 3' transkryptu RNA. Rodzaj włączanego nukleotydu określają reguły łączenia się zada w pary: A tworzy parę z T lub U, G tworzy parę z C. Podczas dodawania każdego kolejnego nukleotydu usuwane są z niego grupy fosforanowe β i γ, a z nukleotydu znajdującego się na końcu łańcucha polinukleotydowego usuwana jest grupa hydroksylowa przy węglu 3’ reszty cukrowej – dokładnie tak samo jak podczas polimeryzacji DNA.

Rys. 1.13. Synteza RNA zależna od matrycy. Synteza transkryptu RNA zachodzi w kierunku 5′→3′. Matryca DNA jest odczytywana w kierunku 3′→5′, a jej sekwencja determinuje sekwencję transkryptu dzięki łączeniu się komplementarnych zasad w pary

Rodzaje RNA w komórce

Typowa bakteria zawiera 0,05–0,10 pg RNA, co stanowi ok. 6% jej całkowitej masy. Dużo większa komórka ssaków zawiera również więcej RNA (20–30 pg), jednak stanowi to tylko 1% jej masy.

Najlepszym sposobem poznania rodzajów RNA w komórce jest podzielenie ich na kategorie i podkategorie w zależności od pełnionych przez nie funkcji. Istnieje wiele możliwości takiego podziału, jednak schemat pokazany na rys. 1.14 wydaje się najbardziej poglądowy. RNA dzielimy przede wszystkim na RNA kodujący i RNA niekodujący. RNA kodujący obejmuje tylko jedną klasę cząsteczek– RNA informacyjne (mRNA, ang. messenger RNA), które są transkryptami genów kodujących białka, a więc ulegają translacji na białka w drugim etapie ekspresji genomu. Cząsteczki mRNA rzadko stanowią więcej niż 4% całkowitego RNA w komórce, charakteryzują się krótkim okresem półtrwania i są szybko degradowane wkrótce po syntezie. Okres półtrwania bakteryjnych mRNA wynosi nie więcej niż kilka minut, a u eukariontów większość mRNA jest degradowana w ciągu kilku godzin po syntezie. Tak szybki proces degradacji oznacza, że skład transkryptomu nie jest stały i może się szybko zmieniać dzięki zmianie tempa syntezy poszczególnych mRNA.

Rys. 1.14. RNA występujące w komórce. Schemat pokazuje rodzaje RNA (łącznie z prekursorowymi RNA) obecne we wszystkich organizmach oraz te, które występują tylko w komórkach eukariotycznych

Drugi rodzaj RNA nazwano niekodującym, ponieważ nie ulega translacji na białka. Alternatywna nazwa to RNA funkcjonalny, co odzwierciedla fakt, że RNA niekodujacy spełnia istotną rolę w komórce. Istnieje wiele rodzajów funkcjonalnego RNA, najważniejsze z nich to:

• RNA rybosomowe (rRNA) – obecne we wszystkich organizmach i przeważnie stanowiące najliczniejszą klasę RNA w komórce; w aktywnie dzielących się bakteriach stanowią one ponad 80% całkowitego RNA; cząsteczki te są składnikiem rybosomów, struktur, na których zachodzi synteza białek (sekcja 13.3);

• RNA transportujące (tRNA) (ang. transfer RNA) – małe cząsteczki, które również biorą udział w syntezie białek i podobnie jak rRNA występują we wszystkich organizmach; funkcją tRNA jest dostarczenie aminokwasów do rybosomu i zapewnienie, że aminokwasy są łączone w kolejności zapisanej w sekwencji nukleotydowej mRNA ulegającego translacji (sekcja 13.3).

rRNA i tRNA to dwie najważniejsze kategorie niekodujących RNA, jednak znanych jest wiele innych rodzajów cząsteczek RNA pełniących wyspecjalizowane funkcje w komórkach eukariotycznych lub bakteryjnych. U eukariontów takie RNA są zwykle klasyfikowane do dwóch grup: krótkie niekodujace RNA (sncRNA) (ang. short noncoding RNA), nie dłuższe niż 200 nukleotydów, i długie niekodujące RNA (lncRNA) (ang. long noncoding RNA), dłuższe niż 200 nukleotydów. Różne funkcje tych niekodujących RNA zostaną omówione w rozdziale 12.

Wiele RNA jest syntetyzowanych jako cząsteczki prekursorowe

Oprócz opisanych powyżej dojrzałych cząsteczek RNA komórki zawierają również cząsteczki prekursorowe. Wiele RNA, szczególnie u eukariontów, jest wyjściowo syntetyzowane jako prekursorowe RNA, czyli pre-RNA, które muszą ulec procesowi dojrzewania, zanim będą mogły pełnić swoje funkcje.

Najważniejszym etapem procesu dojrzewania jest składanie RNA (ang. splicing), polegające na usuwaniu fragmentów z prekursorowego RNA. Niektóre geny eukariotyczne zawierają wewnętrzne segmenty, które są kopiowane w czasie transkrypcji, a następnie wycinane z pre-RNA (rys. 1.15). Te wycinane segmenty to introny, natomiast eksony to segmenty, które są ze sobą składane, by stworzyć dojrzały RNA. Introny występują w niektórych genach kodujących rRNA i tRNA, ale najczęściej w genach kodujących białka. Dlatego składanie pre-mRNA jest bardzo istotną częścią procesu prowadzącego do syntezy części transkryptomu kodującej białka (sekcja 12.4). Składanie RNA zachodzi w jądrze, w którym nieposkładane cząsteczki pre-mRNA tworzą frakcję jądrowego RNA zwaną heterogennym jądrowym RNA (hnRNA, ang. heterogenous nuclear RNA).

Rys. 1.15. Składanie eukariotycznego mRNA. Z pre-mRNA są wycinane introny, a eksony są ponownie łączone ze sobą i tworzą funkcjonalny RNA

Składanie nie jest jedynym rodzajem cięcia występującym w trakcie procesu dojrzewania pre-RNA. Wiele cząsteczek rRNA i tRNA jest początkowo synetyzowanych jako cząsteczki prekursorowe, które zawierają kopię więcej niż jednej cząsteczki. Dlatego pre-rRNA i pre-tRNA są w procesie dojrzewania cięte na kawałki, co prowadzi do powstania dojrzałych RNA (rys. 1.16). Ten typ dojrzewania występuje zarówno u prokariontów, jak i eukariontów.

Rys. 1.16. Dojrzewanie bakteryjnych pre-rRNA. Bakteryjne pre-rRNA zawierają po jednej kopii każdego z trzech rodzajów rRNA, którepo połączeniu z białkami rybosomowymi tworzą rybosom bakteryjny. Następujące po sobie reakcje cięcia i przycinania uwalniają dojrzałe rRNA z cząsteczki prekursorowej

Inne etapy procesu dojrzewania prowadzą do zmian na końcach cząsteczki RNA. Takie modyfikacje końców zachodzą w czasie syntezy eukariotycznych mRNA, z których większość na końcu 5' ma dołączoną strukturę zwaną czapeczką, a na końcu 3' – ogon poli(A). Czapeczka to zmodyfikowany nukleotyd 7-metyloguanozyny, który jest przyłączany do pierwszego nukleotydu pre-mRNA poprzez nietypowe wiązanie trifosforanowe (rys. 1.17A). Pierwszy i drugi nukleotyd pre-mRNA może być również modyfikowany przez dodanie grupy metylowej. Czapeczka jest potrzebna w procesie inicjacji translacji mRNA, w wyniku której syntetyzowane jest białko. Ogon poli(A) składa się z łańcucha nukleotydów adeninowych, o długości do 250 nukleotydów, obecnych na końcu 3' cząsteczki mRNA. mRNA jest cięty blisko końca 3', a następnie do tego nowo powstałego końca 3' dodawane są adeniny przez polimerazę RNA niezależną od matrycy, zwaną polimerazą poli(A) (rys. 1.17B). Nie w pełni rozumiemy rolę procesu poliadenylacji, jednak wiadomo, że mRNA jest degradowany, jeśli brakuje ogona poli(A) lub jest on krótszy niż zwykle.

Rys. 1.17. Modyfikacja końców 5’ i 3’ eukariotycznych mRNA. (A) Struktura czapeczki na końcu 5’ mRNA. Czapeczkę typu 0 tworzy zmodyfikowany nukleotyd 7-metyloguanozyny połączony wiązaniem trifosforanowym 5′-5′ z pierwszym nukleotydem pre-mRNA. Przyłączenie dodatkowych grup metylowych w zaznaczonych pozycjach prowadzi do powstania czapeczki typu 1 i czapeczki typu 2. (B) Poliadenylacja końca 3′ mRNA. Sekwencja ogona poli(A) nie jest zakodowana w DNA, a więc nie jest syntetyzowana przez polimerazę RNA w procesie transkrypcji genu. Ogon poli(A) jest dodawany po transkrypcji przez polimerazę poli(A)

Końcowym etapem w procesie dojrzewania RNA są modyfikacje chemiczne. Niektóre zasady w rRNA i tRNA wszystkich organizmów są modyfikowane poprzez metylację, deaminację (usunięcie grupy -NH2) i/lub podstawienie siarki (wymiana atomu tlenu na atom siarki). Niektóre zasady podlegają również wewnętrznym rearanżacjom, które prowadzą do zmiany położenia poszczególnych grup i/lub przekształcenia wiązań podwójnych w pojedyncze (rys. 1.18). Nie wiadomo, jaki jest cel wielu takich modyfikacji, choć opisano ich funkcję w pewnych specyficznych przypadkach. W tRNA niektóre ze zmodyfikowanych nukleotydów są rozpoznawane przez enzymy przyłączające aminokwas do końca 3' cząsteczki, co ma kluczowe znaczenie dla funkcji tRNA w syntezie białek. Właściwy aminokwas musi być przyłączony do odpowiedniej cząsteczki tRNA i uważa się, że modyfikacje tRNA umożliwiają zachodzenie tego procesu z odpowiednią specyficznością.

Również nieliczne eukariotyczne mRNA podlegają modyfikacjom chemicznym. Ten nieczęsty proces, zwany redagowaniem RNA, jest ważny, gdyż zmienia informację biologiczną zawartą w mRNA w taki sposób, że kodowane przez nie białko ma zmienioną strukturę.

Rys. 1.18. Przykłady chemicznie zmodyfikowanych zasad występujących w rRNA i tRNA. Na pomarańczowo zaznaczono różnice między zasadą standardową a pochodzącą od niej zasadą zmodyfikowaną

Znanym przykładem redagowania RNA są zmiany w ludzkim mRNA dla apolipoproteiny B. Występują dwie wersje tego białka: syntetyzowana w komórkach jelita apolipoproteina B48 i niemal dwa razy dłuższa apolipoproteina B100 syntetyzowana w komórkach wątroby. Obydwa białka biorą udział w transporcie lipidów w organizmie, jednak ich specyficzne funkcje są różne. Białko B48 jest częścią struktury transportującej o nazwie chylomikron, natomiast B100 w połączeniu z innymi białkami tworzy kompleks zwany lipoproteiną bardzo niskiej gęstości (ang. very low density lipoprotein). Obydwie wersje apolipoproteiny B są kodowane przez ten sam gen, ale w komórkach jelita cytozyna w pozycji 6666 14000-nukleotydowego mRNA jest redagowana w reakcji deaminacji. Ta zmiana wystarczy, by przekształcić mRNA apolipoproteiny B100 w mRNA kodujący apolipoproteinę B 48 (rys. 1.19).

Rys. 1.19. Redagowanie mRNA ludzkiej apolipoproteiny B. Deaminacja cytozyny w pozycji 6666 mRNA przekształca ją w uracyl, co prowadzi do powstania kodonu terminacyjnego (sygnału terminacji translacji) i powstania skróconej formy apolipoproteiny B syntetyzowanej w komórkach jelita

Różne definicje transkryptomu

Chociaż większość biologów definiuje obecnie transkryptom jako cały RNA komórki, jednak ten wprowadzony w 1997 r. termin początkowo odnosił się tylko do mRNA. mRNA stanowi mniej niż 4% całego komórkowego RNA, ale często jest uważany za jego najistotniejszy składnik, ponieważ zawiera kodujące RNA wykorzystywane w kolejnym etapie ekspresji genomu. Nawet u najprostszych organizmów, takich jak bakterie i drożdże, wiele genów kodujących białka jest aktywnych tylko w pewnym okresie. Dlatego mRNA komórki nie jest jednorodny i zawiera kopie setek, jeśli nie tysięcy różnych genów. Cały mRNA komórki określa zestaw białek wytwarzanych przez komórkę, determinując jej biochemiczne właściwości. Celem wielu wcześniejszych badań transkryptomu było zidentyfikowanie wszystkich lub jak największej liczby komórkowych mRNA, aby zrozumieć ogólny wzór ekspresji genów oraz to, jak ten wzór się zmienia, np. wtedy, gdy komórka rakowacieje. Ten rodzaj badań jest ważny również dzisiaj (sekcja 12.5), ale ponieważ skupia się na mRNA, ciągle istnieje tendencja, by mówiąc o transkryptomie, odnosić się tylko do mRNA komórki.

Szersza definicja transkryptomu, która obejmuje wszystkie rodzaje RNA w komórce, odzwierciedla nasze rosnące zrozumienie tego, jak ważne funkcje w określeniu biochemicznych własności komórki odgrywają niekodujące RNA. W szczególności sncRNA, zwane mikroRNA (miRNA), regulują ekspresję genów w komórkach eukariotycznych, biorąc udział w procesie degradacji tych cząsteczek mRNA, których produkty nie są już potrzebne (sekcja 12.3). Komórki ludzkie mogą syntetyzować ok. 1000 rodzajów miRNA, specyficznych dla pojedynczych mRNA lub małych grup mRNA. Zrozumienie tego, jaki rodzaj miRNA jest syntetyzowany w poszczególnych komórkach, oraz tego, jak wzór syntezy miRNA zmienia się w czasie choroby, jest istotnym uzupełnieniem odpowiednich badań dotyczących mRNA. Objęcie definicją transkryptomu wszystkich RNA komórki ma sens, ponieważ skupienie się tylko na mRNA prowadzi do pominięcia fundamentalnej roli pozostałych części transkryptomu w regulacji ekspresji informacji biologicznej zakodowanej w genomie.

1.3. Białka i proteom

Kolejnym produktem ekspresji genomu jest proteom (patrz rys.1.2), zestaw białek komórki określający, jakie reakcje biochemiczne dana komórka może przeprowadzać. Białka te są syntetyzowane w procesie translacji cząsteczek RNA wchodzących w skład transkryptomu.

Cztery hierarchiczne poziomy struktury białka

Białka, podobnie jak DNA, są liniowymi, nierozgałęzionymi polimerami. Monomeryczna podjednostka w białkach nazywana jest aminokwasem (rys. 1.20), a polimer – polipeptydem. Jego długość rzadko przekracza 2000 jednostek.

Rys. 1.20. Ogólna struktura aminokwasu. Ogólna struktura wszystkich aminokwasów jest taka sama. Zbudowane są one z atomu węgla α połączonego z atomem wodoru, grupą karboksylową, grupą aminową i grupą R. Aminokwasy różnią się między sobą grupami R (patrz rys. 1.24)

Tradycyjnie uważa się, że białka mają cztery różne poziomy struktury, które są hierarchiczne. Białko budowane jest stopniowo i każdy poziom struktury zależy od poziomu poprzedzającego.

1. Struktura pierwszorzędowa białka powstaje przez połączenie aminokwasów w polipeptyd przez wiązania peptydowe. Polipeptydy są syntetyzowane w wyniku reakcji kondensacji między grupą karboksylową jednego aminokwasu i grupą aminową drugiego aminokwasu (rys. 1.21). Zwróćmy uwagę na to, że podobnie jak w przypadku polinukleotydów dwa końce polipeptydu są chemicznie różne. Na jednym znajduje się wolna grupa aminowa i dlatego nazywa się go końcem aminowym, końcem NH2 lub końcem N. Na drugim – wolna grupa karboksylowa i nazywa się go końcem karboksylowym, końcem COOH lub końcem C. Kierunek polipeptydu można więc zapisać albo jako N→C (od lewej do prawej na rys. 1.21) albo jako C→N (od prawej do lewej na rys. 1.21).

Rys. 1.21. Aminokwasy w polipeptydach połączone są wiązaniami peptydowymi. Na rysunku pokazano reakcję chemiczną, w wyniku której dwa aminokwasy zostają połączone wiązaniem peptydowym. Jest to reakcja kondensacji, ponieważ w jej wyniku uwolniona zostaje cząsteczka wody

2. Struktura drugorzędowa to różne konformacje, jakie może przybierać polipeptyd. Dwa zasadnicze typy struktur drugorzędowych to helisa α i harmonijka β (β kartka) (rys. 1.22). Obydwie te struktury są stabilizowane głównie przez wiązania wodorowe, które powstają między różnymi aminokwasami w polipeptydzie. Większość polipeptydów ma wystarczającą długość, by sfałdować się w serie struktur drugorzędowych, jedna po drugiej, wzdłuż cząsteczki.

Rys. 1.22. Dwa zasadnicze typy struktur drugorzędowych występujących w białkach: (A) helisa α, (B) harmonijka β (β kartka). Łańcuch polipeptydowy pokazano schematycznie. Dla jasności pominięto grupy R. Obydwie struktury są stabilizowane przez wiązania wodorowe między grupami C = O i N—H wchodzącymi w skład różnych wiązań peptydowych. Pokazana na rysunku harmonijka β jest przeciwbieżna – dwa łańcuchy są skierowane przeciwnie. Istnieją również harmonijki β, w których łańcuchy są skierowane zgodnie

3. Struktura trzeciorzędowa jest wynikiem zwijania struktur drugorzędowych polipeptydu w trójwymiarową konfigurację (rys. 1.23). Struktura trzeciorzędowa jest stabilizowana przez różne rodzaje oddziaływań. Są to głównie wiązania wodorowe między poszczególnymi aminokwasami, oddziaływania elektrostatyczne między naładowanymi grupami R aminokwasów oraz efekty hydrofobowe decydujące o tym, że aminokwasy mające niepolarne łańcuchy boczne (tzn. charakteryzujące się „awersją do wody”) muszą być schowane przed wodą i wchodzą w skład wewnętrznych części białka. Możliwe jest również powstawanie kowalencyjnych wiązań disulfidowych, zwanych też mostkami dwusiarczkowymi, które powstają między cysteinami znajdującymi się w różnych miejscach polipeptydu.

Rys. 1.23. Trzeciorzędowa struktura białka. Hipotetyczna struktura białka składającego się z trzech helis α (spirale) i czteroniciowej harmonijki β (strzałki)

4. Struktura czwartorzędowa powstaje przez połączenie dwóch lub więcej polipeptydów w białko składające się z kilku podjednostek, z których każda sfałdowana jest w strukturę trzeciorzędową. Nie wszystkie białka tworzą struktury czwartego rzędu. Jest to cecha wielu białek pełniących skomplikowane funkcje, w tym białek biorących udział w ekspresji genomu. Niektóre struktury czwartorzędowe utrzymują się dzięki mostkom dwusiarczkowym łączącym różne polipeptydy. Dzięki temu powstają zbudowane z wielu podjednostek stabilne białka, które niełatwo rozdzielić na części składowe. Inne struktury czwartorzędowe są luźniejszym połączeniem podjednostek stabilizowanym przez wiązania wodorowe i oddziaływania hydrofobowe. Oznacza to, że białka te mogą rozpadać się na składowe polipeptydy lub wymieniać swoje podjednostki zależnie od funkcjonalnych wymagań komórki.

Różnorodność białek wynika z różnorodności aminokwasów

Funkcjonalna różnorodność białek wynika z tego, że tworzące je aminokwasy są chemicznie różne. Dlatego łączenie się aminokwasów w rozmaite sekwencje prowadzi do powstawania różnych kombinacji reaktywności chemicznych, od których zależy nie tylko ogólna struktura powstającego białka, lecz także umiejscowienie grup aktywnych na jego powierzchni, co determinuje właściwości chemiczne białka.

Przyczyną różnorodności aminokwasów są grupy R, które bardzo różnią się strukturą i są inne w każdym aminokwasie. Białka zbudowane są z 20 aminokwasów (rys. 1.24, tab. 1.2). Niektóre mają małe grupy R, o stosunkowo prostej budowie, jak atom wodoru w glicynie lub grupa metylowa w alaninie. Inne aminokwasy, jak fenyloalanina, tryptofan i tyrozyna, mają duże aromatyczne łańcuchy boczne o złożonej strukturze. Większość grup R jest nienaładowana w pH 7,4, co jest fizjologicznym pH większości komórek i tkanek. Dwa aminokwasy są naładowane ujemnie (kwas asparaginowy i glutaminowy), a trzy dodatnio (arginina, histydyna i lizyna). Część aminokwasów ma polarne łańcuchy boczne (np. seryna i treonina), w innych są one niepolarne (np. alanina, leucyna i walina).

Tabela 1.2. Skróty nazw aminokwasów

Aminokwas

Skrót

Skrót trzyliterowy

Skrót jednoliterowy

Alanina

Ala

A

Arginina

Arg

R

Asparagina

Asn

N

Kwas asparaginowy

Asp

D

Cysteina

Cys

C

Kwas glutaminowy

Glu

E

Glutamina

Gln

Q

Glicyna

Gly

G

Histydyna

His

H

Izoleucyna

Ile

I

Leucyna

Leu

L

Lizyna

Lys

K

Metionina

Met

M

Fenyloalanina

Phe

F

Prolina

Pro

P

Seryna

Ser

S

Treonina

Thr

T

Tryptofan

Trp

W

Tyrozyna

Tyr

Y

Walina

Val

V

Rys. 1.24. Struktura grup R aminokwasów. Dwadzieścia aminokwasów pokazanych na rysunku to te, które są tradycyjnie klasyfikowane jako aminokwasy określane przez kod genetyczny. W przypadku proliny pokazano strukturę całego aminokwasu, nie tylko grupy R, ponieważ ma ona nietypową budowę. Grupa R proliny jest połączona wiązaniem nie tylko z węglem α, lecz także z powiazaną z nim grupą aminową

Dwadzieścia aminokwasów pokazanych na rys. 1.24 to te tradycyjnie klasyfikowane jako aminokwasy określane przez kod genetyczny. Są to więc aminokwasy łączone ze sobą w czasie translacji cząsteczek mRNA na białka. Jednak chemiczna różnorodność białek nie ogranicza się tylko do tych 20 aminokwasów. Dwa czynniki powodują zwiększenie różnorodności białek:

• w czasie syntezy białka do łańcucha polipeptydowego mogą być włączane przynajmniej dwa dodatkowe aminokwasy nietypowe – selenocysteina i pirolizyna (rys. 1.25); ich włączenie zależy od zmodyfikowanego sposobu odczytu kodu genetycznego;

Rys. 1.25. Struktura selenocysteiny i pirolizyny. Na czerwono zaznaczono różnice między selenocycteiną a cysteiną oraz między lizyną a pirolizyną

• niektóre białka są modyfikowane w procesie ich obróbki potranslacyjnej przez dodanie nowych grup chemicznych, np. hydroksylację, acetylację albo fosforylację, lub przez przyłączenie dużych łańcuchów bocznych składających się z reszt cukrowych (sekcja 13.3.4).

Dlatego białka charakteryzują się ogromną chemiczną zmiennością, z której część jest określana przez genom, a reszta jest wynikiem procesu obróbki potranslacyjnej.

Powiązanie transkryptomu z proteomem

Proteom składa się z białek obecnych w danym momencie w komórce. Uważa się, że typowa komórka ssaków, np. hepatocyt wątroby, zawiera 10 000–20 000 różnych rodzajów białek – ok. 8 × 109 pojedynczych cząsteczek. Łącznie to ok. 0,5 ng białka, co stanowi 18–20% całkowitej masy komórki. Liczba cząsteczek poszczególnych białek jest bardzo zmienna – od 20 000 cząsteczek na komórkę dla najmniej licznych, do ponad 100 milionów dla najliczniejszych. Każde białko występujące w komórce w liczbie większej niż 50 000 cząsteczek na komórkę uważane jest za stosunkowo liczne. W typowej komórce ssaków ok. 2000 białek należy do tej kategorii. Gdy porównuje się proteomy różnych komórek ssaków, obserwuje się tylko niewielkie różnice dotyczące klasy białek licznych. Sugeruje to, że większość z nich należy do białek metabolizmu podstawowego (ang. housekeeping proteins), biorących udział w podstawowych reakcjach biochemicznych w komórce. Białka związane z wyspecjalizowanymi funkcjami komórki są przeważnie stosunkowo nieliczne, chociaż istnieją wyjątki, np. ogromne ilości hemoglobiny w komórkach czerwonych krwinek.

Proteom jest syntetyzowany w procesie translacji mRNA, który jest częścią składową transkryptomu. Na początku lat 50., wkrótce po odkryciu struktury podwójnej helisy DNA, wielu biologów molekularnych starało się wymyślić, w jaki sposób aminokwasy mogłyby przyłączać się do mRNA w uporządkowany sposób. Jednak we wszystkich proponowanych modelach przynajmniej kilka wiązań musiałoby być krótszych lub dłuższych niż dopuszczalna odległość zgodna z prawami chemii fizycznej i dlatego wszystkie te modele odrzucono. Niepewność tą ostatecznie rozwiał w 1957 r. Francis Crick, przewidując istnienie cząsteczki adaptorowej, która mogłaby łączyć mRNA z syntetyzowanym polipeptydem. Wkrótce potem uświadomiono sobie, że cząsteczkami adaptorowymi są tRNA. Po uznaniu tego faktu zwrócono uwagę na rybosomy – struktury, na których syntetyzowane są białka. Stopniowo zrozumiano szczegóły procesu translacji mRNA na białka (sekcja 13.3).

Innym aspektem procesu syntezy białek, który interesował biologów molekularnych w latach 50., był problem informacyjny odnoszący się do drugiego istotnego powiązania transkryptomu z proteomem: kod genetyczny powinien określać, w jaki sposób sekwencja mRNA jest tłumaczona na sekwencję aminokwasów w białku. W latach 50. XX w. zorientowano się, że kod genetyczny, aby mógł kodować informację o wszystkich 20 aminokwasach wchodzących w skład białek, musi być kodem trójkowym. Oznacza to, że jeden znak kodu, czyli kodon, musi składać się z trzech nukleotydów. Kod dwuliterowy miałby tylko 42 = 16 kodonów, co nie wystarcza do zakodowania wszystkich 20 aminokwasów, podczas gdy kod trzyliterowy może mieć 43 = 64 kodony. Kod genetyczny rozszyfrowano w latach 60. na podstawie analizy polipeptydów powstałych po translacji syntetycznych mRNA o znanej lub przewidywalnej sekwencji w bezkomórkowych systemach translacji. Zastosowano również testy wykorzystujące oczyszczone rybosomy i pozwalające określić, jakie aminokwasy wiążą się z rybosomem w obecności mRNA o znanej sekwencji. Po ukończeniu tych doświadczeń okazało się, że 64 kodony można podzielić na grupy. Kodony wchodzące w skład jednej grupy kodują jeden aminokwas (rys. 1.26). Tylko tryptofan i metionina kodowane są przez jeden kodon, wszystkie pozostałe aminokwasy przez dwa, trzy, cztery lub sześć kodonów. Dlatego mówimy, że kod genetyczny jest zdegenerowany. Kod ma także cztery kodony przestankowe, które określają w mRNA miejsce rozpoczęcia i zakończenia translacji sekwencji nukleotydowej (rys. 1.27). Kodonem inicjacyjnym jest zwykle trójka 5'-AUG-3', kodująca również metioninę, co powoduje, że większość nowo zsyntetyzowanych polipeptydów rozpoczyna się od metioniny. Jako inicjacyjne, szczególnie u bakterii, mogą być również wykorzystywane inne kodony, takie jak 5'-GUG-3' i 5'-UUG-3'. Trzy kodony terminacyjne to 5'-UAG-3’, 5’-UAA-3' i 5'-UGA-3'.

Rys. 1.26. Kod genetyczny. Kodony w mRNA są odczytywane w kierunku 5′→3′ Objaśnienie trzyliterowych skrótów nazw aminokwasów – tab. 1.2

Rys. 1.27. Położenie kodonów przestankowych w mRNA

Kod genetyczny nie jest uniwersalny

Początkowo sądzono, że kod genetyczny musi być taki sam we wszystkich organizmach. Uważano, że po powstaniu kodu jakakolwiek jego zmiana byłaby niemożliwa, gdyż wprowadzałaby nowe znaczenie poszczególnych kodonów. Prowadziłoby to do dużych zmian w sekwencji aminokwasowej białek. Rozumowanie to wydaje się trafne, ale, co dziwne, w rzeczywistości kod genetyczny nie jest uniwersalny. Kod przedstawiony na rys. 1.26 jest wykorzystywany w ogromnej większości genów prawie we wszystkich organizmach, choć odstępstwa od tej zasady są często spotykane. W szczególności genomy mitochondrialne często wykorzystują kodony niestandardowe (tab. 1.3A). Po raz pierwszy odkryła to w 1979 r. grupa Frederika Sangera z Cambridge w Wielkiej Brytanii. Badacze ci stwierdzili, że wiele ludzkich genów mitochondrialnych zawiera kodony 5'-UGA-3', które zazwyczaj pełnią funkcję kodonów terminacyjnych. Kodony te występowały w pozycjach środkowych, w których nie spodziewano się zatrzymywania translacji. Analiza sekwencji białek kodowanych przez te geny wykazała, że kodon 5'-UGA-3' jest w ludzkich mitochondriach kodonem tryptofanowym oraz że w tym szczególnym systemie genetycznym jest to tylko jedno z czterech odstępstw od kodu standardowego. Również w innych organizmach geny mitochondrialne wykazują odstępstwa od standardowego kodu genetycznego. Jednak przynajmniej w jednym z tych przypadków, a mianowicie zastosowania kodonu 5'-CGG-3' jako kodonu tryptofanowego w mitochondriach roślin, prawdopodobnie jest to korygowane w procesie redagowania RNA przed rozpoczęciem translacji.

Niestandardowe kodony są również wykorzystywane w genomach jądrowych niższych Eukaryota. Często modyfikacja ogranicza się do niewielkiej grupy organizmów i przeważnie polega na zmianie znaczenia kodonów terminacyjnych (tab. 1.3B). Wśród Prokaryota modyfikacje są rzadsze, znane są pojedyncze przypadki u gatunków Mycoplasma i Micrococcus. Ważniejszą zmianą kodu jest zmiana znaczenia kodonu zależna od kontekstu, z którą mamy do czynienia, gdy syntetyzowane białko zawiera selenocysteinę lub pirolizynę. Białka zawierające pirolizynę występują rzadko, prawdopodobnie tylko w grupie archeonów (rozdz. 8). Jednak białka zawierające selenocysteinę są dość rozpowszechnione u wielu organizmów. Należy do nich np. peroksydaza glutationowa, chroniąca komórki człowieka i innych ssaków przed uszkodzeniami oksydacyjnymi. Selenocysteina jest kodowana przez kodon 5'-UGA-3', a pirolizyna przez kodon 5'-UAG-3'. W omawianych organizmach kodony te mają więc podwójne znaczenie, ponieważ są również ciągle wykorzystywane jako kodony terminacyjne (tab. 1.3C). Kodon 5'-UGA-3' kodujący selenocysteinę jest odróżniany od prawdziwych kodonów terminacyjnych dzięki obecności na mRNA struktury typu łodyżka–pętelka (ang. stem–loop), w której pętelka tworzy się przez zagięcie mRNA do tyłu i jednoczesne parowanie zasad tworzących łodyżkę utrzymującą całą strukturę (rys. 1.28). U Prokaryota struktura ta położona jest tuż poniżej (ang. downstream) kodonu selenocysteinowego, a u Eukaryota w obrębie regionu 3' niepodlegajacemu translacji (3''UTR), tzn. w części mRNA znajdującej się poniżej kodonu terminacyjnego. W procesie rozpoznania kodonu selenocysteinowego niezbędne jest oddziaływanie między strukturą łodyżka–pętelka a specjalnym białkiem biorącym udział w translacji tych mRNA. Podobny system działa prawdopodobnie przy rozpoznawaniu kodonu pirolizynowego.

Rys. 1.28. Zmiana znaczenia kodonu 5′-UGA-3′ zależna od kontekstu. Kodon 5′-UGA-3′ kodujący selenocysteinę jest odróżniany dzięki obecności na mRNA struktury typu łodyżka–pętelka. U Prokaryota (pokazane na rysunku) struktura ta położona jest tuż poniżej kodonu selenocysteinowego, a u Eukaryota w obrębie regionu 3′UTR

Tabela 1.3. Odstępstwa od standardowego kodu genetycznego

Organizm

Kodon

Standardowo koduje

W tym przypadku koduje

(A) Genomy mitochondrialne

Ssaki

UGA

Stop

Trp

AGA, AGG

Arg

Stop

AUA

Ile

Met

Drosophila

UGA

Stop

Trp

AGA

Arg

Ser

AUA

Ile

Met

Saccharomyces cerevisiae

UGA

Stop

Trp

CUN

Leu

Thr

AUA

Ile

Met

Grzyby

UGA

Stop

Trp

Kukurydza

CGG

Arg

Trp

(B) Genomy jądrowe i prokariotyczne

Niektóre pierwotniaki

UAA, UAG

Stop

Gln

Candida cylindracea

CUG

Leu

Ser

Micrococcus sp.

AGA

Arg

Stop

AUA

Ile

Stop

Euplotes sp.

UGA

Stop

Cys

Mycoplasma sp.

UGA

Stop

Trp

CGG

Arg

Stop

(C) Zmiana znaczenia kodonu zależna od kontekstu

Różne organizmy

UGA

stop

selenocysteinę

Archeony

UAG

stop

pirolizynę

Skrót: N – dowolny nukleotyd

Powiązanie proteomu z biochemią komórki

Końcowym wynikiem ekspresji informacji genetycznej zakodowanej w genomie jest białko, którego biologiczne właściwości determinuje sfałdowana struktura i przestrzenne rozmieszczenie grup chemicznych na jej powierzchni. Dzięki temu, że genom koduje różnego rodzaju białka, może on budować i zachowywać proteom, którego ogólne właściwości biologiczne tworzą podstawy życia. Proteom pełni tę rolę dzięki ogromnej różnorodności struktur białkowych, które mogą się tworzyć. Pozwala to białkom pełnić wiele biologicznych funkcji, do których należą:

• kataliza biochemiczna przeprowadzana przez specyficzny rodzaj białek zwanych enzymami – enzymy są katalizatorami reakcji głównych szlaków metabolicznych dostarczających komórce energię oraz reakcji biosyntetycznych, w wyniku których powstają kwasy nukleinowe, białka, węglowodany i tłuszcze; kataliza biochemiczna kieruje również ekspresją genomu przez aktywność enzymów, takich jak polimeraza RNA;

• struktura, na poziomie komórkowym determinowana przez białka budujące cytoszkielet – jej utrzymanie jest podstawową funkcją części białek zewnątrzkomórkowych; przykładem jest kolagen, ważny składnik kości i ścięgien;

• ruch zależny od białek kurczliwych, z których najbardziej znane to aktyna i miozyna, tworzące włókna cytoszkieletu;

• transport różnych związków chemicznych w organizmie związany z istotną aktywnością białek, np. hemoglobina transportuje tlen we krwi, a albumina osocza – kwasy tłuszczowe;

• regulacja procesów komórkowych, w której pośredniczą białka, takie jak czynniki transkrypcyjne wiążące się z genomem i wpływające na poziom ekspresji zarówno pojedynczych genów, jak i grup genów (sekcja 12.2); aktywność grup komórek regulują i koordynują zewnątrzkomórkowe hormony i cytokiny, z których wiele jest białkami, np. insulina kontrolująca poziom cukru we krwi lub intrleukiny – grupa cytokin regulujących podział i różnicowanie komórek;

• ochrona organizmu i poszczególnych komórek jest funkcją wielu białek, takich jak przeciwciała oraz białka uczestniczące w procesie krzepnięcia krwi;

• funkcje magazynowania są związane z białkami takimi jak ferrytyna, która gromadzi żelazo w wątrobie, oraz gliadyny – białka zapasowe, które są magazynem aminokwasów w spoczynkowych nasionach pszenicy.

Dzięki tak zróżnicowanym funkcjom białek proteom może przekształcić zapisany w genomie plan w zasadnicze właściwości procesów życia.

Podsumowanie

• Każdy organizm na naszej planecie ma genom przechowujący informację biologiczną.

• Większość genomów jest zbudowana z DNA, z wyjątkiem niektórych genomów wirusowych zbudowanych z RNA.

• Ekspresja genomu jest procesem, w którym informacja zawarta w genomie jest przekazywana do komórki.

• Pierwszym produktem ekspresji genomu jest transkryptom – zbiór cząsteczek mRNA powstałych po transkrypcji genów aktywnych w komórce w określonym czasie.

• Kolejnym produktem jest proteom – zbiór białek komórki określający charakter reakcji biochemicznych, które dana komórka może przeprowadzać.

• Dowody eksperymentalne potwierdzające, że geny są zbudowane z DNA, otrzymano po raz pierwszy w latach 1945–1952, jednak dopiero odkrycie podwójnej helisy przez Watsona i Cricka w 1953 r. przekonało biologów, że DNA jest faktycznie materiałem genetycznym.

• DNA jest nierozgałęzionym polinukleotydem zbudowanym z wielu kopii czterech chemicznie różnych nukleotydów.

• W podwójnej helisie dwa polinukleotydy są owinięte wokół siebie tak, że zasady azotowe znajdują się wewnątrz cząsteczki.

• Polinukleotydy łączą się wiązaniami wodorowymi pomiędzy zasadami: A zawsze tworzy parę z T, a G – zawsze z C.

• RNA jest również polinukleotydem, ale poszczególne nukleotydy mają inną strukturę niż nukleotydy w DNA. RNA jest zwykle jednoniciowy.

• Komórki zawierają różne rodzaje RNA, między innymi mRNA, które są transkryptami genów kodujących białka, a także wiele innych niekodujących RNA.

• Wiele RNA jest syntetyzowanych wyjściowo jako cząsteczki prekursorowe. Aby uzyskać ostateczną formę, podlegają one dojrzewaniu – reakcjom cięcia i łączenia końców oraz modyfikacjom chemicznym.

• Białka są również nierozgałęzionymi polimerami zbudowanymi z aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi.

• Sekwencja aminokwasów jest pierwszorzędową strukturą białka. Struktury wyższego rzędu – drugorzędowa, trzeciorzędowa i czwartorzędowa – tworzą się przez zwinięcie struktury pierwszorzędowej w trójwymiarowe konformacje oraz przez łączenie się pojedynczych polipeptydów w białka składające się z wielu podjednostek.

• Funkcjonalna różnorodność białek wynika z tego, że tworzące je aminokwasy mają różne właściwości chemicznie. Dlatego łączenie się aminokwasów w rozmaite sekwencje prowadzi do powstania białek różniących się reaktywnością chemiczną.

• Białka są syntetyzowane w procesie translacji, zgodnie z zasadami kodu genetycznego określającego, jaki aminokwas jest kodowany przez daną trójkę (tryplet) nukleotydów.

• Kod genetyczny nie jest uniwersalny. Odstępstwa od jego zasad występują w mitochondriach i u niższych eukariontów. Niektóre kodony w obrębie jednego genu mogą mieć dwa różne znaczenia.

Krótkie pytania otwarte

1. Kiedy i kto odkrył DNA; wykazał, że DNA jest materiałem genetycznym, odkrył strukturę DNA? Kiedy scharakteryzowano pierwszy genom?

2. Jakie dwa rodzaje oddziaływań chemicznych stabilizują strukturę podwójnej helisy?

3. Dlaczego specyficzne łączenie się zasad w pary (A łączy się z T, a G z C) jest podstawą wierności procesu replikacji DNA?

4. Jakie są istotne różnice chemiczne między RNA i DNA?

5. Dlaczego niekodujące RNA również nazywane są funkcjonalnymi RNA?

6. Przedstaw różne sposoby dojrzewania cząsteczek RNA.

7. Czy komórki kiedykolwiek mogą nie mieć transkryptomu? Uzasadnij swoją odpowiedź.

8. Dlaczego wiązania wodorowe, oddziaływania elektrostatyczne i oddziaływania hydrofobowe odgrywają ważną rolę w pierwszorzędowej, drugorzędowej, trzeciorzędowej i czwartorzędowej strukturze białek?

9. Dlaczego białka mogą tak bardzo różnić się strukturalnie i funkcjonalnie, skoro są syntetyzowane tylko z 20 aminokwasów?

10. Chemiczna różnorodność białek wynika z tego, że składają się z 20 aminokwasów oraz z dwóch dodatkowych czynników. Jakie to czynniki i jakie mają znaczenie?

11. W jaki sposób kodon 5'-UGA-3' funkcjonuje zarówno jako kodon stop, jak i kodon zmodyfikowanego aminokwasu selenocysteiny?

12. W jaki sposób genom kieruje aktywnością biologiczną komórki?

Pytania problemowe

1. W tekście jest stwierdzenie, że Watson i Crick odkryli strukturę podwójnej helisy DNA w sobotę 7 marca 1953 r. Uzasadnij to stwierdzenie.

2. Przedyskutuj, dlaczego podwójna helisa prawie natychmiast uzyskała ogólną akceptację jako właściwa struktura DNA.

3. Jakie eksperymenty doprowadziły do rozszyfrowania kodu genetycznego w latach 60. XX w.?

4. Dlaczego polipeptydy mogą występować w wielu różnych formach strukturalnych, a polinukleotydy nie?

5. Uważa się, że transkryptom i proteom są, odpowiednio, pośrednim i końcowym produktem ekspresji genomu. Oceń zalety i ograniczenia tych definicji dla naszego rozumienia ekspresji genomu.

Literatura uzupełniająca

Książki i artykuły opisujące odkrycie podwójnej helisy oraz inne ważne momenty przełomowe w badaniach DNA

Brock, T.D. (1990) The Emergence of Bacterial Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (opisuje szczegółowo prace nad czynnikiem transformującym oraz doświadczenia Hersheya i Chase).

Judson, H.F. (1996) The Eighth Day of Creation: Makers of the Revolution in Biology. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (bardzo poczytny opis rozwoju biologii molekularnej do lat 90.).

Kay, L.E. (1997) The Molecular Vision of Life. Oxford University Press, Oxford (zawiera szczegółowe wyjaśnienie, dlaczego początkowo uważano, że geny są zbudowane z białek).

Lander, E.S., Weinberg, R.A. (2000) Genomics: journey to the center of biology. Science 287:1777–1782 (krótki opis genetyki i biologii molekularnej od Mendla do sekwencji genomu ludzkiego).

Maddox, B. (2003) Rosalind Franklin: The Dark Lady of DNA. HarperCollins, London.

McCarty, M. (1986) The Transforming Principle: Discovering that Genes are Made of DNA. Norton, London.

Olby, R. (2003) The Path to the Double Helix. Dover Publications, Mineola, New York (naukowy opis badań, które doprowadziły do odkrycia podwójnej helisy).

Watson, J.D. (1968) The Double Helix. Atheneum, London (najważniejsze odkrycie XX w. opisane w stylu opery mydlanej).

Artykuły oryginalne i przeglądowe opisujące ważne aspekty dotyczące struktury DNA, RNA i białek

Altona, C., Sundaralingam, M. (1972) Conformational analysis of the sugar ring in nucleosides and nucleotides: a new description using the concept of pseudorotation. J. Am. Chem. Soc. 94:8205–8212 (informacje na temat konformacji cukrów).

Eisenberg, D. (2003) The discovery of the α-helix and β-sheet, the principal structural features of proteins. Proc. Natl Acad. Sci. USA 100:11207–11210.

Pauling, L., Corey, R.B. (1951) The pleated sheet, a new layer configuration of polypeptide chains. Proc. Natl Acad. Sci. USA 37:251–256 (pierwszy opis harmonijki β – β kartki).

Pauling, L., Corey, R.B., Branson, H.R. (1951) The structure of proteins: two hydrogen-bonded helical configurations of the polypeptide chain. Proc. Natl Acad. Sci. USA 37:205–211 (pierwszy opis helisy α).

Rich, A., Zhang, S. (2003) Z-DNA: the long road to biological function. Nat. Rev. Genet. 4:566–572.

Watson, J.D., Crick, F.H.C. (1953) Molecular structure of nucleic acids: a structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 171:737–738 (naukowy opis odkrycia struktury podwójnej helisy DNA).

Yakovchuk, P., Protozanova, E, Frank-Kamenetskii, M.D. (2006) Base-stacking and base-pairing contributions into thermal stability of the DNA double helix. Nucleic Acids Res. 34:564–574.

2. Analiza DNA

Właściwie wszystko, co wiemy o genomach i ekspresji genomów, zostało odkryte dzięki badaniom naukowym: rozważania teoretyczne grały niewielką rolę w tym czy w innych obszarach biologii molekularnej i komórkowej. Można posiąść „wiedzę” o genomach, nie wiedząc wiele o tym, jak tę wiedzę zdobyto, ale aby osiągnąć prawdziwe zrozumienie przedmiotu, należy szczegółowo poznać techniki i podejścia naukowe stosowane do badania genomów. Kolejne pięć rozdziałów obejmuje takie właśnie metody badań. Na początek w tym rozdziale przedstawimy metody wykorzystywane do badania DNA, skupiając się na reakcji łańcuchowej polimerazy i klonowaniu DNA. Techniki te są bardzo wydajne dla krótkich odcinków DNA, z pojedynczymi genami włącznie, i umożliwiają uzyskanie na tym poziomie wielu informacji. Rozdział 3 prowadzi nas ku metodom stworzonym do konstrukcji map genomów. Rozdział 4 opisuje metody stosowane do sekwencjonowania cząsteczek DNA i do składania krótkich sekwencji generowanych tymi metodami w długie sekwencje stanowiące całe chromosomy i genomy. Na koniec, w rozdziałach 5 i 6, przyglądamy się różnym podejściom wykorzystywanym do określenia lokalizacji genów w sekwencji genomu i identyfikacji ich funkcji. W trakcie czytania tych rozdziałów zaczniecie doceniać, że zrozumienie struktury i funkcji pojedynczego genomu jest dużym przedsięwzięciem i że badania są obecnie w połowie ekscytującej fazy, w której nowe techniki i podejścia pozwalają na odkrywanie niemal co tydzień nowych i nieoczekiwanych aspektów genomów.

Zestaw technik stosowanych przez biologów molekularnych do badania cząsteczek DNA został skompletowany w latach 70. i 80. XX w. Przedtem jedynym sposobem badania pojedynczych genów była genetyka klasyczna, wykorzystująca techniki sięgające połowy XIX w., czyli czasów Mendla. Rozwój bardziej bezpośrednich metod badania DNA stymulowały przełomy w badaniach biochemicznych, które we wczesnych latach 70. dostarczyły biologom molekularnym enzymów nadających się do manipulowania DNA w probówce. Enzymy te występują naturalnie w żywych komórkach i uczestniczą w takich procesach jak replikacja, naprawa i rekombinacja, które poznamy w rozdziałach 15–17. W celu ustalenia funkcji tych enzymów wiele z nich oczyszczono i zbadano katalizowane przez nie reakcje. Biolodzy molekularni zaadaptowali następnie oczyszczone enzymy jako narzędzia do manipulacji cząsteczkami DNA w z góry zaplanowany sposób, wykorzystując je do tworzenia kopii cząsteczek DNA, cięcia cząsteczek DNA na mniejsze fragmenty i ponownego ich łączenia w kombinacje nieistniejące w naturze (rys. 2.1). Te manipulacje tworzą podstawę technologii rekombinowania DNA, dzięki której konstruuje się nowe lub „rekombinowane” cząsteczki DNA z kawałków naturalnie występujących chromosomów i plazmidów.

Rys. 2.1. Przykłady manipulacji, które można przeprowadzić z cząsteczkami DNA

Metodologia rekombinowania DNA doprowadziła do rozwoju reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR, ang. polymerase chain reaction). PCR jest niezwykle prostą techniką – osiąga się dzięki niej jedynie powtarzalne kopiowanie krótkiej cząsteczki DNA (rys. 2.2) – jednak okazała się niezwykle istotna w wielu dziedzinach badań biologicznych, a badanie genomów nie jest ostatnim z nich. PCR szczegółowo omówiono w sekcji 2.2. Techniki rekombinowania DNA leżą także u podstawy klonowania DNA lub klonowania genów, w którym krótkie fragmenty DNA wstawia się do plazmidu lub materiału genetycznego wirusa i replikuje w bakteriach lub komórkach eukariotycznych (rys. 2.3). To, w jaki sposób przeprowadza się klonowanie genów, oraz przyczyny, dla których technika ta jest ważna dla badań genomów, prześledzimy w sekcji 2.3.

Rys. 2.2. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest używana do tworzenia kopii wybranych segmentów cząsteczki DNA. W tym przykładzie jest kopiowany jeden gen

Rys. 2.3. Klonowanie DNA. W tym przykładzie fragment DNA do sklonowania wstawia się do wektora plazmidowego, który następnie replikuje się wewnątrz komórki bakteryjnej gospodarza

2.1. Enzymy służące do manipulacji DNA

Technologia rekombinowania DNA była jednym z głównych czynników mających udział w szybkim postępie wiedzy dotyczącej ekspresji genów, który nastąpił w latach 70. i 80. XX w. Podstawą technologii rekombinowania DNA jest możliwość manipulacji cząsteczkami DNA w probówce. To z kolei zależy od dostępności oczyszczonych enzymów o znanych i poddających się kontroli aktywnościach, które można zastosować do wprowadzenia specyficznych zmian w poddawanych manipulacji cząsteczkach DNA. Enzymy dostępne dla biologa molekularnego należą do czterech szerokich kategorii:

• polimerazy DNA, które są enzymami syntetyzującymi nowe polinukleotydy komplementarne do istniejącej matrycy DNA lub RNA (rys. 2.4A),

• nukleazy, które degradują cząsteczki DNA przez rozrywanie wiązań fosfodiestrowych łączących jeden nukleotyd z drugim (rys. 2.4B),

• ligazy, które łączą ze sobą cząsteczki DNA przez syntezę wiązań fosfodiestrowych między nukleotydami na końcach dwóch różnych cząsteczek lub na dwóch końcach pojedynczej cząsteczki (rys. 2.4C),

• enzymy modyfikujące końce, które zmieniają końce cząsteczek DNA (rys. 2.4D).

Rys. 2.4. Aktywność (A) polimeraz, (B) nukleaz i (C) ligaz oraz (D) enzymów modyfikujących końce. (A) Aktywność polimerazy DNA zależnej od DNA (po lewej) i polimerazy DNA zależnej od RNA (po prawej). (B) Aktywności endonukleaz i egzonukleaz. (C) Zielona cząsteczka DNA jest łączona sama z sobą (po lewej) i z drugą cząsteczką DNA (po prawej). (D) Pokazana jest aktywność terminalnej deoksynukleotydylotransferazy: enzym ten dodaje nukleotydy do końców dwuniciowej cząsteczki DNA

Sposób działania polimerazy DNA zależnej od matrycy

Wiele technik używanych do badania DNA opiera się na syntezie kopii DNA całych lub części istniejących cząsteczek DNA lub RNA. Jest to zasadnicze wymaganie dla reakcji PCR (sekcja 2.2), sekwencjonowania DNA (sekcje 4.1 i 4.2) i wielu innych procedur znajdujących się w centrum zainteresowania biologii molekularnej. Enzym syntetyzujący DNA nazywa się polimerazą DNA, a taki, który kopiuje istniejącą cząsteczkę DNA lub RNA, nazywa się polimerazą DNA zależną od matrycy. Polimeraza DNA zależna od matrycy tworzy nowy polinukleotyd DNA, którego sekwencja jest narzucona zgodnie z regułami tworzenia się par zasad przez sekwencję nukleotydów kopiowanej cząsteczki DNA lub RNA (rys. 2.5). Nowy polinukleotyd jest zawsze syntetyzowany w kierunku 5'→3': polimerazy DNA tworzące DNA w przeciwnym kierunku nie są znane w naturze.

Rys. 2.5. Aktywność polimerazy DNA zależnej od DNA. Nowe nukleotydy są dodawane do końca 3' rosnącego polinukleotydu, którego sekwencję determinuje sekwencja DNA matrycowego. Porównaj z procesem transkrypcji (syntezy RNA zależnej od DNA) pokazanym na rys. 1.13

Ważną cechą syntezy DNA zależnej od matrycy jest to, że polimeraza DNA jest niezdolna do wykorzystania jako matrycy cząsteczki całkowicie jednoniciowej. W celu rozpoczęcia syntezy DNA musi istnieć krótki obszar dwuniciowy, by dostarczyć końca 3', do którego enzym doda nowe nukleotydy (rys. 2.6A). W jaki sposób to wymaganie jest spełniane w żywych komórkach, gdy genom podlega replikacji, opisano w rozdziale 15. W probówce reakcję kopiowania DNA rozpoczyna się przez przyłączenie do matrycy krótkiego syntetycznego oligonukleotydu, zwykle długości ok. 20 nukleotydów, który działa jako starter do syntezy DNA. Na pierwszy rzut oka potrzeba istnienia startera może zdawać się niepożądaną komplikacją w zastosowaniu polimeraz DNA w technologii rekombinowania DNA, ale trudno bardziej się mylić. Ponieważ przyłączanie startera do matrycy zależy od tworzenia się par zgodnie z zasadami komplementarności, o tym, w jakiej pozycji w obrębie matrycy rozpocznie się kopiowanie DNA, może decydować zsyntetyzowanie startera o odpowiedniej sekwencji nukleotydowej (rys. 2.6B). Można zatem skopiować krótki specyficzny segment znacznie dłuższej cząsteczki matrycowej, co jest znacznie bardziej wartościowe niż kopiowanie losowe, które zaszłoby, gdyby synteza DNA nie wymagała startera. Wagę konieczności stosowania stertera można będzie w pełni docenić, zmagając się z opisem reakcji PCR w sekcji 2.2.

Rys. 2.6. Rola startera w syntezie DNA zależnej od matrycy. (A) Do inicjacji syntezy nowego polinukleotydu przez polimerazę DNA konieczny jest starter. (B) Sekwencja tego oligonukleotydu determinuje pozycję, w której przyłącza się on do matrycy DNA, a zatem precyzuje region matrycy, który będzie kopiowany. Gdy używa się polimerazy DNA do stworzenia nowego DNA in vitro, starter jest zwykle krótkim oligonukleotydem zsyntetyzowanym chemicznie

Drugą istotną cechą polimeraz DNA zależnych od matrycy jest to, że wiele z nich to enzymy wielofunkcyjne, zdolne zarówno do degradacji cząsteczek DNA, jak i ich syntezy. Odzwierciedla to, w jaki sposób polimerazy DNA działają w komórce w czasie replikacji genomu (sekcja 15.3). Oprócz zdolności syntezy DNA 5'→3' polimerazy DNA mogą także mieć jedną lub obie aktywności egzonukleolityczne (rys. 2.7).

Rys. 2.7. Synteza DNA i aktywności egzonukleolityczne polimeraz DNA. (A) Aktywność syntezy DNA 5'→3' umożliwia polimerazie dodawanie nukleotydów do końca 3' syntetyzowanej nici. (B) Aktywność egzonukleazy 3'→5' umożliwia polimerazie usuwanie jednego lub większej liczby nukleotydów z końca 3' tworzonej nici. (C) Aktywność egzonukleazy 5'→3' umożliwia polimerazie usuwanie jednego lub większej liczby nukleotydów z końca 5’ polinukleotydu, który jest przyłączony do nici matrycowej

• Aktywność 3'→5' egzonukleazy umożliwia usuwanie nukleotydów z końca 3' świeżo syntetyzowanej nici. Nazywa się to aktywnością korekcyjną, ponieważ pozwala polimerazie korygować błędy przez usunięcie omyłkowo wstawionego nukleotydu.

• Aktywność 5'→3' egzonukleazy jest mniej powszechna, ale występuje w tych rodzajach polimeraz DNA, w których naturalna funkcja w replikacji genomu wymaga zdolności usuwania przynajmniej części polinukleotydu już przyłączonego do nici matrycowej, kopiowanej przez polimerazę.

Typy polimeraz DNA stosowane w badaniach naukowych

Kilka polimeraz DNA zależnych od matrycy stosowanych w biologii molekularnej (tab. 2.1) jest wersjami polimerazy DNA I Escherichia coli, enzymu, który odgrywa główną rolę w replikacji genomu tej bakterii (sekcja 15.3). Enzym ten, czasem nazywany polimerazą Kornberga, od nazwiska jego odkrywcy Arthura Kornberga, ma obie aktywności egzonukleolityczne 3'→5' i 5'→3', co ogranicza jego użyteczność w manipulowaniu DNA. Jego głównym zastosowaniem jest synteza cząsteczek DNA zawierających nukleotydy radioaktywne lub fluorescencyjne, zwana znakowaniem DNA.

Tabela 2.1. Cechy polimeraz DNA zależnych od matrycy używanych w badaniach w biologii molekularnej

Polimeraza

Opis

Główne zastosowanie

Szczegóły

Polimeraza DNA I

Niemodyfikowany enzym E. coli

Znakowanie DNA

Sekcja 2.1

Polimeraza Klenowa

Zmodyfikowana wersja polimerazy DNA I E. coli

Znakowanie DNA

Sekcja 2.1 i 4.1

Polimeraza Taq

Polimeraza DNA I Thermus aquaticus

PCR

Sekcja 2.2

Odwrotna transkryptaza

Polimeraza DNA zależna od RNA, otrzymywana

z różnych retrowirusów

Synteza cDNA

Sekcja 3.6 i 5.3

Z dwóch aktywności egzonukleolitycznych wersja 5'→3' powoduje większość problemów, gdy polimeraza DNA jest stosowana do manipulacji cząsteczkami w probówce. Dzieje się tak, ponieważ enzym mający tę aktywność jest zdolny usuwać nukleotydy z końca 5' polinukleotydu, który właśnie został zsyntetyzowany (rys. 2.8). Mało prawdopodobne, że polinukleotyd ulegnie całkowitej degradacji, ponieważ aktywność polimerazowa zwykle znacznie przewyższa aktywność egzonukleolityczną, ale niektóre techniki nie będą działać, jeśli końce 5' nowych polipeptydów będą skracane w jakikolwiek sposób. W szczególności niektóre starsze techniki sekwencjonowania DNA opierają się na syntezie nowych polinukleotydów, które wszystkie mają dokładnie taki sam koniec 5', oznaczony starterem zastosowanym do zainicjowania reakcji sekwencjonowania. Jeśli nastąpi jakiekolwiek „obgryzanie” końców 5', niemożliwe stanie się ustalenie prawidłowej sekwencji DNA. Właśnie dlatego, gdy po raz pierwszy wprowadzono sekwencjonowanie DNA w późnych latach 70., wykorzystywało ono zmodyfikowaną wersję enzymu Kornberga, zwaną polimerazą Klenowa. Polimerazę Klenowa pierwotnie wypreparowano przez cięcie naturalnego enzymu polimerazy DNA I E. coli na dwa segmenty z użyciem proteazy. Jeden z tych fragmentów zachował aktywność polimerazy i egzonukleazy 3'→5', ale utracił funkcję egzonukleazy 5'→3' nietrawionego enzymu. Obecnie enzym jest prawie zawsze izolowany z komórek E. coli, których gen polimerazy zmodyfikowano tak, że uzyskany enzym ma pożądane właściwości.

Optimum temperatury reakcji dla enzymu polimerazy DNA I E. coli wynosi 37°C, gdyż jest to temperatura naturalnego środowiska tej bakterii wewnątrz jelit ssaków, takich jak człowiek. Reakcje w probówkach z polimerazami Kornberga czy Klenowa przeprowadza się więc w temperaturze 37°C i kończy przez podniesienie temperatury przynajmniej do 75°C, co powoduje rozwinięcie się białka, jego denaturację, niszczącą aktywność enzymatyczną. Ten porządek jest w pełni odpowiedni dla większości technik biologii molekularnej, ale z przyczyn, które staną się jaśniejsze w sekcji 2.2, do PCR konieczna jest termostabilna polimeraza DNA – taka, która może działać w temperaturach znacznie wyższych niż 37°C. Odpowiednie enzymy można otrzymać z bakterii, takich jak Thermus aquaticus, żyjących w gorących źródłach w temperaturze do 95°C, których enzym polimerazy DNA I ma optimum termiczne działania w temperaturze 75–80°C. Biochemiczne podstawy termostabilności białka nie są w pełni zrozumiane, ale prawdopodobnie polegają głównie na cechach strukturalnych redukujących ilość białka rozwijającego się w podwyższonej temperaturze.

Rys. 2.8. Aktywność egzonukleazy 5'→3' może degradować koniec 5' polinukleotydu, który właśnie został zsyntetyzowany

Jeszcze jeden dodatkowy typ polimerazy DNA jest ważny w biologii molekularnej. Jest nim odwrotna transkryptaza, będąca polimerazą DNA zależną od RNA, a zatem tworzącą kopie DNA na matrycach RNA, a nie DNA. Odwrotne transkryptazy biorą udział w cyklach replikacyjnych retrowirusów (sekcja 9.1), takich jak ludzki wirus braku odporności (HIV), których genomy zbudowane są z RNA i kopiowane na DNA po infekcji gospodarza. W probówce używa się odwrotnej transkryptazy do tworzenia kopii DNA z cząsteczek mRNA. Takie kopie nazywa się komplementarnym DNA (cDNA, ang. complementary DNA). Ich synteza jest istotna w pewnych typach klonowania genów i w technikach stosowanych do mapowania regionów genomu określanych przez szczególne cząsteczki mRNA (sekcja 5.3).

Endonukleazy restrykcyjne umożliwiają cięcie cząsteczek DNA w ściśle określonych pozycjach

W technologii rekombinowania DNA zastosowanie znalazły różnorodne nukleazy (tab. 2.2). Pewne z nich mają szeroki zakres aktywności, ale większość jest albo egzonukleazami usuwającymi nukleotydy z końców cząsteczek DNA i/lub RNA, albo endonukleazami tnącymi wewnętrzne wiązania fosfodiestrowe. Niektóre nukleazy są specyficzne względem DNA, inne względem RNA, pewne działają jedynie na dwuniciowy DNA, inne tylko na jednoniciowy DNA, a niektórym nie robi różnicy, na co działają. W kolejnych rozdziałach napotkamy różnorodne przykłady nukleaz, gdy będziemy omawiać techniki, w których się je stosuje. Tylko jeden typ nukleazy zostanie omówiony szczegółowo: endonukleazy restrykcyjne, które odgrywają główną rolę w wielu aspektach technologii rekombinowania DNA.

Tabela 2.2. Cechy ważnych nukleaz używanych w badaniach w biologii molekularnej

Nukleaza

Opis

Główne zastosowanie

Szczegóły

Endonukleazy restrykcyjne

Endonukleazy restrykcyjne DNA specyficzne

względem sekwencji, z wielu źródeł

Liczne zastosowania

Sekcja 2.1

Nukleaza S1

Endonukleazy specyficzne względem jednoniciowego DNA i RNA, z grzyba Aspergillus oryzae

Mapowanie transkryptów

Sekcja 5.2

Deoksyrybonukleaza I

Endonukleaza specyficzna względem dwuniciowego DNA i RNA, z Escherichia coli

Odcisk stopy DNAzy I (ang. nuclease footprinting)

Sekcja 7.1

Endonukleaza restrykcyjna jest enzymem, który wiąże się z cząsteczką DNA w obrębie specyficznej sekwencji i tworzy dwuniciowe nacięcie w miejscu lub blisko tej sekwencji. Specyficzność sekwencyjna pozwala przewidzieć pozycje cięć w obrębie cząsteczki DNA, jeśli znana jest jej sekwencja, umożliwiając wycięcie ściśle określonych segmentów z większej cząsteczki. Ta właściwość leży u podstawy klonowania genów i wszystkich innych aspektów technologii rekombinacji DNA, w których potrzebne są fragmenty DNA o znanej sekwencji.

Istnieją trzy typy endonukleaz restrykcyjnych. W przypadku restryktaz typu I i III nie ma ścisłej kontroli położenia miejsca cięcia względem rozpoznawanej sekwencji cząsteczki DNA. Enzymy te są zatem mniej użyteczne, ponieważ sekwencje powstałych fragmentów nie są znane z wystarczającą precyzją. Enzymy typu II są pozbawione tej niekorzystnej cechy, ponieważ cięcie następuje zawsze w tym samym miejscu – albo w obrębie sekwencji rozpoznawanej, albo blisko niej (rys. 2.9). Na przykład enzym typu II zwany EcoRI (izolowany z E. coli) tnie DNA tylko w obrębie heksanukleotydu 5'-GAATTC-3'. Trawienie DNA enzymem typu II daje więc powtarzalny zestaw fragmentów przewidywalnej długości, jeśli znana jest sekwencja docelowej cząsteczki DNA. Wyizolowano ponad 4000 enzymów typu II, a ponad 600 jest dostępne do wykorzystania w laboratorium. Wiele enzymów rozpoznaje sekwencje sześcionukleotydowe, a inne rozpoznają sekwencje dłuższe lub krótsze (tab. 2.3). Znane są także przykłady enzymów rozpoznających sekwencje zdegenerowane, co oznacza, że tną DNA w miejscu należącym do rodziny pokrewnych miejsc. Na przykład HinfI (z Haemophilus influenzae) rozpoznaje 5'-GANTC-3', a więc tnie: 5'-GAATC-3', 5'-GATTC-3', 5'-GAGTC-3' i 5'-GACTC-3'. Większość enzymów tnie w obrębie rozpoznawanej sekwencji, ale kilka, jak BsrBI, tnie w określonej pozycji poza tą sekwencją.

Rys. 2.9. Nacięcia tworzone przez endonukleazy restrykcyjne. U góry: endonukleaza restrykcyjna typu I lub III nacina DNA w pozycjach nieznacznie się różniących względem rozpoznawanej sekwencji, więc powstają fragmenty różnej długości. U dołu: użyto enzymu typu II. Każda cząsteczka jest cięta w dokładnie takiej samej pozycji na dokładnie taką samą parę fragmentów

Tabela 2.3. Kilka przykładów endonukleaz restrykcyjnych

Enzym

Sekwencja rozpoznawana

Typy końców

Sekwencje końców

AluI

5'-AGCT-3'

3'-TCGA-5'

Tępe

5'-AG CT-3'

3'-TC GA-5'

Sau3AI

5'-GATC-3'

3'-CTAG-5'

Lepkie, fragment jednoniciowy (5')

5'- GATC-3'

3'-CTAG -5'

HinfI

5'-GANTC-3'

3'-CTNAG-5'

Lepkie, fragment jednoniciowy (5')

5'-G ANTC-3'

3'-CTNA G-5'

BamHI

5'-GGATCC-3'

3'-CCTAGG-5'

Lepkie, fragment jednoniciowy (5')

5'-G GATCC-3'

3'-CCTAG G-5'

BsrBI

5'-CCGCTC-3'

3'-GGCGAG-5'

Tępe

5'- NNNCCGCTC-3'

3'- NNNGGCGAG-5'

EcoRI

5'-GAATTC-3'

3'-CTTAAG-5'

Lepkie, fragment jednoniciowy (5')

5'-G AATTC-3'

3'-CTTAA G-5'

PstI

5'-CTGCAG-3'

3'-GACGTC-5'

Lepkie, fragment jednoniciowy (3')

5'-CTGCA G-3'

3'-G ACGTC-5'

NotI

5'-GCGGCCGC-3'

3'-CGCCGGCG-5'

Lepkie, fragment jednoniciowy (5')

5'-GC GGCCGC-3'

3'-CGCCGG CG-5'

BglI

5'-GCCNNNNNGGC-3'

3'-CGGNNNNNCCG-5'

Lepkie, fragment jednoniciowy (3')

5'-GCCNNNN NGGC-3'

3'-CGGN NNNNCCG-5'

Skrót: N – jakikolwiek nukleotyd

Zauważ, że większość sekwencji rozpoznawanych (ale nie wszystkie) ma odwróconą symetrię: gdy się je czyta w kierunku 5'→3', sekwencja jest taka sama w obu niciach.

Enzymy restrykcyjne mogą ciąć DNA na dwa różne sposoby. Wiele robi po prostu dwuniciowe nacięcie, dające tępy koniec, a inne tną dwie nici DNA w różnych miejscach odległych o dwa do czterech nukleotydów, powodując, że fragmenty DNA mają na końcach krótkie jednoniciowe fragmenty. Takie końce nazywa się lepkimi, ponieważ łączenie się zasad w pary między nimi może ponownie skleić cząsteczkę DNA (rys. 2.10A). Pewne enzymy dające lepkie końce zostawiają fragmenty jednoniciowe na końcu 5' (np. Sau3AI, HinfI), inne na końcu 3' (np. PstI) (rys. 2.10B). Szczególnie istotne w technologii rekombinowania DNA jest to, że niektóre pary enzymów restrykcyjnych rozpoznają różne sekwencje, ale dają takie same lepkie końce. Przykładami są Sau3AI i BamHI, które oba dają lepki koniec 5'-GATC-3', mimo że Sau3AI rozpoznaje sekwencję czteronukleotydową, a BamHI – sześcionukleotydową (rys. 2.10C).

Rys. 2.10. Wyniki trawienia DNA różnymi endonukleazami restrykcyjnymi. (A) Tępe końce i lepkie końce. (B) Różne typy lepkich końców: 5' wytwarzane przez BamHI i 3' wytwarzane przez PstI. (C) Takie same lepkie końce wytwarzane przez dwie różne endonukleazy restrykcyjne: lepki koniec 5' o sekwencji 5'-GATC-3' wytwarzają enzymy: BamHI (rozpoznaje 5'-GGATCC-3') i Sau3AI (rozpoznaje 5'-GATC-3')

Do analizy wyników trawienia restrykcyjnego wykorzystuje się elektroforezę w żelu

Działanie endonukleazą restrykcyjną prowadzi do pocięcia większej cząsteczki DNA na mniejsze fragmenty. W jaki sposób mierzy się wielkość tych fragmentów? Odpowiedzią jest elektroforeza w żelu. Jest to standardowa metoda rozdzielania cząsteczek DNA o różnej wielkości. Ma wiele zastosowań w analizie DNA, ale także może być wykorzystana do rozdzielania cząsteczek RNA.

Elektroforeza to przemieszczanie się naładowanych cząsteczek w polu elektrycznym. Ujemnie naładowane cząsteczki wędrują w kierunku elektrody dodatniej, a dodatnio naładowane – w kierunku elektrody ujemnej. Pierwotnie elektroforezę przeprowadzano w roztworze wodnym, gdzie przeważającymi czynnikami wpływającymi na tempo migracji w roztworze są kształt cząsteczki i jej ładunek. Okazało się to nieprzydatne do rozdzielania DNA, gdyż większość cząsteczek DNA ma taki sam kształt (liniowy), a choć ładunek cząsteczki DNA zależy od jej długości, różnice ładunku nie są wystarczające do efektywnego rozdziału (rys. 2.11A). Sytuacja zmienia się, gdy elektroforezę przeprowadza się w żelu, ponieważ wtedy kształt i ładunek mają mniejsze znaczenie, a krytyczna dla migracji staje się długość cząsteczki. Dzieje się tak dlatego, że żel jest siecią porów, przez które cząsteczki DNA muszą się przeciskać, aby dotrzeć do dodatniej elektrody. Krótsze cząsteczki są słabiej zatrzymywane przez pory, a więc wędrują przez żel szybciej niż cząsteczki dłuższe. Cząsteczki o różnej wielkości tworzą na żelu prążki (rys. 2.11B).

Rys. 2.11. Elektroforetyczny rozdział cząsteczek DNA o różnych długościach. (A) Standardowa elektroforeza w roztworze wodnym nie rozdziela fragmentów DNA o różnych wielkościach. (B) Elektroforeza w żelu pozwala na taki rozdział

W biologii molekularnej używa się dwóch rodzajów żelu: opisanego tutaj żelu agarozowego i żelu poliakrylamidowego, głównie używanego do sekwencjonowania DNA (sekcja 4.1). Agaroza to polisacharyd tworzący żele o porach osiągających od 100 do 300 nm średnicy; wielkość zależy od stężenia agarozy w żelu. Stężenie żelu określa rozmiar fragmentów DNA, które można rozdzielić. Na zakres rozdzielania ma także wpływ wartość elektroendoosmotyczna (EEO) agarozy, tj. miara liczby związanych anionów siarczanowych i pirogronianowych. Im większe EEO, tym wolniejsze tempo migracji ujemnie naładowanych cząsteczek, takich jak DNA.

Żel agarozowy przygotowuje się przez zmieszanie odpowiedniej ilości agarozy w proszku z buforem, podgrzanie w celu rozpuszczenia agarozy i wylanie rozpuszczonej agarozy na płytkę z pleksiglasu, którą okleja się taśmą, aby nie przeciekała. W żelu umieszcza się grzebień, by utworzyć studzienki (inaczej kieszonki) na próbki. Żel pozostawia się do zastygnięcia, a następnie przeprowadza się elektroforezę w żelu zanurzonym w buforze. Przed naniesieniem do próbek dodaje się jeden lub dwa barwniki o znanej szybkości migracji, aby można było śledzić postęp elektroforezy. Prążki DNA uwidacznia się przez zanurzenie żelu w roztworze bromku etydyny. Związek ten interkaluje między pary zasad DNA i fluoryzuje po aktywacji promieniowaniem ultrafioletowym (rys. 2.12). Niestety procedura ta jest ryzykowna, gdyż bromek etydyny jest potężnym mutagenem. W wielu laboratoriach wykorzystuje się więc barwniki niemutagenne, barwiące DNA na zielono, czerwono czy niebiesko. Najbardziej czułe barwniki pozwalają na wykrycie prążków zawierających mniej niż 1 ng DNA, w porównaniu do 10 ng DNA, które można wykryć, wykorzystując bromek etydyny.

Rys. 2.12. Prążki DNA w żelu agarozowym uwidacznia się przez barwienie bromkiem etydyny

Zależnie od stężenia agarozy w żelu po elektroforezie można rozdzielić na wyraźne prążki fragmenty długości od 100 bp (par zasad) do 50 tysięcy par zasad (kilobaz, kb) (rys. 2.13). Na przykład żel o grubości 0,5 cm i stężeniu agarozy 0,5%, który ma względnie duże pory, można wykorzystać do rozdziału cząsteczek. Używa się do cząsteczek 1–30 kb, co pozwala np. na rozróżnienie cząsteczek o wielkości 10 i 12 kb. Żel o stężeniu 0,3% można wykorzystać do cząsteczek większych, do 50 kb, a żel 5% do cząsteczek 100–500 bp.

Rys. 2.13. Wielkość fragmentów, które można rozdzielić, zależy od stężenia agarozy w żelu. Elektroforezę przeprowadzono w trzech różnych stężeniach agarozy. Oznaczono rozmiary prążków w lewym i prawym paśmie. Fot. dzięki uprzejmości Bio-Whittaker Molecular Applications

Fragmenty DNA można identyfikować metodą hybrydyzacji Southerna

Gdy wyjściowy DNA jest stosunkowo krótką cząsteczką i po trawieniu restrykcyjnym powstaje dwadzieścia lub mniej fragmentów, zwykle udaje się dobrać takie stężenie agarozy, aby każdy fragment był widoczny jako samodzielny prążek na żelu. Jeśli wyjściowy DNA jest długi, a zatem daje więcej fragmentów po trawieniu enzymem restrykcyjnym, to niezależnie od użytego stężenia agarozy na żelu będzie po prostu widać smugę DNA, ponieważ w próbce są fragmenty wszelkich możliwych długości, których prążki się zlewają. Taki jest zwykle wynik, gdy enzymem restrykcyjnym trawi się DNA genomowy.

Jeśli znana jest sekwencja wyjściowego DNA, to sekwencje, a co za tym idzie – rozmiary fragmentów powstałych w wyniku trawienia konkretnym enzymem restrykcyjnym – można przewidzieć. Prążek z pożądanym fragmentem (np. zawierający gen) można wtedy zidentyfikować, wyciąć z żelu i oczyścić DNA. Nawet jeśli nieznany jest rozmiar, fragment zawierający gen lub inny interesujący segment DNA można zidentyfikować za pomocą techniki zwanej hybrydyzacją metodą Southerna. Jedynym warunkiem jest znajomość lub możliwość przewidzenia choć części sekwencji w obrębie poszukiwanego genu lub fragmentu DNA. Pierwszym etapem jest przeniesienie fragmentów restrykcyjnych z żelu agarozowego na membranę nylonową lub nitrocelulozową. Przeprowadza się to, kładąc membranę na żelu i umożliwiając buforowi przesączanie się i przenoszenie DNA z żelu na membranę, z którą się wiąże (rys. 2.14A). Proces ten prowadzi do unieruchomienia fragmentów DNA na powierzchni membrany w takich samych pozycjach względem siebie.

Rys. 2.14. Hybrydyzacja metodą Southerna. (A) Przenoszenie DNA z żelu na membranę. (B) Membranę hybrydyzuje się z sondą będącą promieniotwórczo wyznakowaną cząsteczką DNA. Na uzyskanym autoradiogramie jeden hybrydyzujący prążek widać w ścieżce 2, a dwa – w ścieżce 3

Następnym etapem jest przygotowanie sondy do hybrydyzacji wyznakowanej cząsteczki DNA o sekwencji komplementarnej do docelowego DNA, który chcemy wykryć. Do znakowania często wykorzystuje się znacznik promieniotwórczy. Można syntetyzować nukleotydy, w których jeden z atomów fosforu jest zamieniony na 32P lub 33P, jeden z atomów tlenu w grupie fosforanowej jest zamieniony na 35S lub jeden lub więcej atomów wodoru zamienia się na 3H. Nukleotydy radioaktywne wciąż działają jako substraty dla polimeraz DNA i są włączane do cząsteczki DNA przy jakiejkolwiek syntezie nici przez polimerazę DNA. Alternatywnie, aby uniknąć ryzyka dla zdrowia i problemów ze składowaniem odpadów radioaktywnych, można wykorzystać nukleotydy zawierające znacznik fluorescencyjny albo emitujący chemiluminescencję.

Sondą może być syntetyczny oligonukleotyd o sekwencji odpowiadającej fragmentowi badanego genu. Ponieważ sonda i docelowy DNA są komplementarne, mogą tworzyć pary zasad, czyli hybrydyzować. Pozycję docelowego fragmentu restrykcyjnego na membranie identyfikuje się, wykrywając sygnał znacznika dołączonego do sondy. Aby przeprowadzić hybrydyzację, membranę umieszcza się w szklanej butelce z wyznakowaną sondą oraz buforem i delikatnie obraca przez kilka godzin, aby sonda miała możliwość hybrydyzowania z docelowym DNA. Następnie membranę płucze się w celu usunięcia sondy, która nie zhybrydyzowała i wykrywa się sygnał znacznika. W przykładzie pokazanym na rys. 2.11B sondę wyznakowano radioaktywnie, a sygnał wykrywa się poprzez ekspozycję filmu czułego na promieniowanie rentgenowskie (autoradiografia). Prążek widoczny na autoradiogramie jest tym, który odpowiada fragmentowi hybrydyzującemu z sondą, zawiera zatem poszukiwany geny. Jeśli wykorzystuje się znacznik fluorescencyjny, stosuje się film wrażliwy na światło o spektrum odpowiadającym spektrum emisyjnemu fluoroforu. Znaczniki chemiluminescencyjne można wykrywać w taki sam sposób, lecz mają one pewną wadę. Sygnał nie jest generowany bezpośrednio przez sondę – musi zostać wywołany przez dodanie odpowiednich odczynników. Popularną metodą jest wyznakowanie DNA fosfatazą alkaliczną, którą wykrywa się przez dodanie dioksetanu, którego defosforylacja przez enzym wzbudza chemiluminescencję. Wszystkie trzy typy sond: radioaktywne, fluorescencyjne i chemiluminescencyjne można wykrywać skanerem cyfrowym, dzięki czemu uzyskuje się natychmiastowy obraz membrany i pozycję sondy bez opóźnienia wynikającego z konieczności ekspozycji filmu.

Ligazy łączą ze sobą fragmenty DNA

Fragmenty DNA utworzone przez trawienie endonukleazami restrykcyjnymi można ponownie ze sobą połączyć lub dołączyć do nowego partnera za pomocą ligazy DNA. Reakcja wymaga energii, której dostarcza się, dodając ATP lub dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NAD, ang. nicotinamide adenine dinucleotide) do mieszaniny reakcyjnej, zależnie od typu używanej ligazy.

Ligazę o najszerszym zastosowaniu otrzymuje się z komórek E. coli infekowanych bakteriofagiem T4. Enzym ten bierze udział w replikacji fagowego DNA i jest kodowany przez genom T4. Jego naturalną rolą jest synteza wiązań fosfodiestrowych między niepołączonymi nukleotydami obecnymi w jednym polinukleotydzie cząsteczki dwuniciowej (rys. 2.15A). Aby połączyć dwa fragmenty restrykcyjne, ligaza musi zsyntetyzować dwa wiązania fosfodiestrowe, po jednym na każdej nici (rys. 2.12B). Nie jest to oczywiście poza zasięgiem możliwości enzymu, ale reakcja może zajść wyłącznie wówczas, gdy końce, które mają zostać połączone, przypadkiem znajdą się wystarczająco blisko siebie; ligaza nie ma zdolności trzymania ich i przybliżenia do siebie. Jeśli dwie cząsteczki mają komplementarne lepkie końce i te końce zbliżą się dzięki losowej dyfuzji w mieszaninie ligacyjnej, mogą utworzyć się przejściowo pary zasad między dwoma lepkimi końcami. Takie pary zasad nie są szczególnie stabilne, ale mogą przetrwać przez czas wystarczający, aby ligaza przyłączyła się do przerwy i zsyntetyzowała wiązania fosfodiestrowe łączące ze sobą końce (rys. 2.15C). Jeśli cząsteczki mają tępe końce, nie mogą tworzyć ze sobą par zasad nawet przejściowo i ligacja jest procesem znacznie mniej wydajnym, nawet gdy stężenie DNA jest duże i pary końców są w stosunkowo blisko siebie.

Rys. 2.15. Łączenie cząsteczek DNA przez ligazę DNA (ligacja). (A) W żywych komórkach ligaza DNA syntetyzuje brakujące wiązanie fosfodiestrowe na jednej nici dwuniciowego DNA. (B) By połączyć dwie cząsteczki DNA in vitro, ligaza DNA musi utworzyć dwa wiązania fosfodiestrowe – na obu niciach. (C) Ligacja in vitro jest wydajniejsza, jeśli cząsteczki mają komplementarne lepkie końce, bo nietrwałe tworzenie par między tymi końcami utrzymuje cząsteczki razem, ułatwiając przyczepienie się ligazy i syntezę nowych wiązań fosfodiestrowych

Większa wydajność ligacji lepkich końców stymulowała rozwój metod zamieniających tępe końce w lepkie. W jednej z metod do tępych końców przyłącza się krótkie dwuniciowe cząsteczki zwane łącznikami lub adaptorami. Łącznik i adaptor działają w nieco inny sposób, ale oba zawierają sekwencję rozpoznawaną przez endonukleazę restrykcyjną i dlatego dają lepkie końce po traktowaniu odpowiednim enzymem (rys. 2.16). Innym sposobem stworzenia lepkiego końca jest dodawanie ogonów homopolimerowych, polegające na dodawaniu nukleotydów jeden po drugim do tępego końca 3' (rys. 2.17). Enzym biorący udział w tym procesie nazywa się terminalną transferazą deoksyrybonukleotydową i zapoznamy się z nim w następnej sekcji. Jeśli mieszanina reakcyjna zawiera DNA i tylko jeden z czterech nukleotydów, to nowy tworzony ciąg jednoniciowego DNA składa się w całości z tego jednego nukleotydu. Może to być np. ogon poli(G), który umożliwi cząsteczce tworzenie par z inną cząsteczką zawierającą ogon poli(C), stworzony w ten sam sposób, ale z dCTP (a nie dGTP) w mieszaninie reakcyjnej.

Rys. 2.16. Łączniki stosuje się do tworzenia lepkich końców na tępo zakończonej cząsteczce. W tym przykładzie każdy łącznik zawiera sekwencję rozpoznawaną przez endonukleazę restrykcyjną BamHI. Ligaza DNA przyczepia łączniki na końcach tępo zakończonej cząsteczki w reakcji zachodzącej dość wydajnie, bo łączniki są obecne w dużym stężeniu. Następnie dodaje się enzym restrykcyjny, aby przeciąć łączniki, dając lepkie końce. Zauważ, że ligaza łączy łączniki ze sobą tak, że ich seria (konkatamer) jest przyłączana na każdym końcu tępo zakończonej cząsteczki. Dodany enzym restrykcyjny tnie konkatamery łączników na segmenty, a połówki najbardziej wewnętrznych pozostają związane z cząsteczką DNA. Adaptory są podobne do łączników, ale każdy ma jeden koniec tępy i jeden lepki. Tępo zakończony DNA dostaje lepki koniec przez ligację z adaptorami: nie trzeba przeprowadzać restrykcji

Rys. 2.17. Dodawanie ogonów homopolimerowych. W tym przykładzie ogon poli(G) jest syntetyzowany na każdym końcu tępo zakończonej cząsteczki DNA. Ogony składające się z innych nukleotydów są syntetyzowane przez włączanie odpowiedniego substratu do mieszaniny reakcyjnej

Enzymy modyfikujące końce

Terminalna transferaza deoksyrybonukleotydowa (patrz rys. 2.17), otrzymywana z grasic cielęcych, jest przykładem enzymów modyfikujących końce. W rzeczywistości jest to polimeraza DNA niezależna od matrycy, ponieważ ma zdolność wydłużania polinukleotydu DNA bez tworzenia par zasad przez nukleotydy włączane do istniejącej nici DNA lub RNA. Jej główną rolą w technologii rekombinacji DNA jest, jak już wspomniano, dodawanie ogonów homopolimerowych.

Również często stosowane są dwa kolejne enzymy modyfikujące końce – fosfataza alkaliczna i kinaza polinukleotydowa T4, których działania się uzupełniają. Fosfataza alkaliczna, otrzymywana z wielu źródeł, np. z E. coli, tkanek jelita cielęcego oraz z krewetki północnej, usuwa grupy fosforanowe z końca 5' cząsteczek DNA, co zapobiega ligacji tych cząsteczek ze sobą. Dwa końce zawierające fosforany na końcu 5' mogą zostać ze sobą połączone, a koniec pozbawiony reszty fosforanowej może zostać połączony przez ligazę z końcem posiadającym resztę fosforanową, ale nie może zostać stworzone połączenie między parą końców, z których żaden nie zawiera fosforanu na końcu 5'. Rozsądnie stosując alkaliczną fosfatazę, można zatem kierować działaniem ligazy DNA w zaplanowany sposób, tak że otrzymuje się tylko żądane produkty ligacji. Kinaza polinukleotydowa T4, otrzymywana z komórek E. coli infekowanych bakteriofagiem T4, przeprowadza reakcję odwrotną do fosfatazy alkalicznej, dodając fosforan na końcach 5'. Tak jak fosfatazę alkaliczną enzym ten wykorzystuje się w czasie skomplikowanych eksperymentów ligacyjnych, ale jego głównym zastosowaniem jest znakowanie końców cząsteczek DNA.